间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)最初是从骨髓中分离得到的非造血类的干细胞,它参与构成骨髓造血微环境,对造血干细胞的增殖与分化具有明显的支持作用。MSCs具有自我更新和多向分化潜能,体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。传统上一直认为,干细胞是通过分化为特定细胞来替代病损的组织器官,间充质干细胞具有直接分化为成骨细胞、软骨细胞的能力,可以通过直接替代损伤细胞从而在大段骨缺损或软骨损伤的修复中发挥作用。随后的研究发现,MSCs具有营养支持与免疫调节功能,可能在组织损伤修复与疾病治疗中扮演了更加重要的角色。例如,MSCs通过旁分泌营养介质(trophic mediators)可以抑制缺血导致的凋亡、抑制瘢痕形成、刺激血管新生和维持血管稳定性、刺激组织内源性干细胞分裂。在MSCs的免疫调节方面,MSCs能抑制T细胞由丝裂原刺激的增殖反应,增加调节性T细胞比例,降低Th1/Th2比例,进而引起Th17数量下降;MSCs可以抑制B细胞的增殖、活化以及其抗体分泌,影响B细胞的趋化功能;MSCs抑制NK细胞增殖、细胞毒作用和细胞因子的分泌;MSCs还影响抗原提呈细胞(APC)的抗原递呈功能,通过下调APC表面的MHC分子以及共刺激分子(CD40、CD86、CD80)和抑制DC细胞成熟来抑制T细胞的活化。参与MSCs免疫调节作用的主要分子包括转化生长因子β(TGFβ)、前列腺素E2(PGE-2)、肿瘤坏死因子诱导蛋白6(TSG6)、一氧化氮(NO)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)等。但抑制上述分子的表达并不能完全逆转MSC的免疫调节功能,提示可能存在未知的调节分子或调控途径参与其中。因此,寻找和发现参与MSCs免疫调节作用的新分子与新途径对于系统阐述MSCs参与损伤修复的机制,推动其临床转化应用具有重要意义。课题组前期的表达谱测序结果发现,胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor bingding protein 7,IGFBP7)基因在免疫调节功能最强的小鼠MSCs亚群中表达最高,提示IGFBP7可能参与小鼠MSCs的免疫调节功能。但其具体参与MSCs的免疫调节机制是值得探讨的科学问题。近年来研究显示,除骨髓外,在脂肪、脐带、肾脏、心脏等多种脏器或组织中均有MSCs的存在,并表现出类似的修复病损组织的功能。本课题组利用Nestin-GFP转基因小鼠研究显示,新生小鼠Nestin除了在中枢和外周神经系统表达外,还广泛分布在骨髓、胰腺、睾丸、肾脏、视网膜、心脏等多个组织;从睾丸、肾脏等组织分选得到的GFP阳性细胞具有自我更新和间质分化能力,证明Nestin是成体组织间质干细胞的特异标志,为进一步获得适合损伤修复的间质干细胞亚群提供了重要依据。进一步从Nestin-GFP小鼠心脏中分离了Nestin+细胞具有间质干细胞特性,并在修复损伤心肌组织中表现出优于骨髓MSCs的治疗作用。因此,不同组织来源的MSCs在修复其对应的靶组织的损伤上是否具有更好的作用?其治疗损伤修复的作用机制如何?有待于深入阐明。因此,本研究内容分为以下2个部分:第一部分:胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在小鼠MSCs免疫调节中的作用机制研究第二部分:心脏来源的Nestin+MSCs治疗小鼠急性心肌梗死模型中的作用机制初探第一部分胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在小鼠MSCs免疫调节中的作用机制研究1.目的目前已知MSCs的免疫调节可能途径有NO、IDO、PGE2、IL-10、TSG6、Galectin1和TGFβ等,除上述分子外,是否还有其它分子参与MSC的免疫调节机制是值得探究的关键科学问题。已有研究显示IFN-gamma受体突变的人MSCs仍有免疫调节功能,并提示IGFBPs可能参与免疫调节,但其调节机制远未阐明;课题组利用表达谱测序发现在免疫调节能力最强的小鼠MSCs亚群中IGFBP7表达水平最高,提示其可能参与了小鼠MSCs的免疫调节功能,据此,本部分研究拟系统揭示IGFBP7参与MSCs的免疫调节功能的作用机制。2.方法2.1利用Q-PCR检测IGFBPs家族成员(IGFBP1-7)在小鼠骨髓MSCs中的表达水平。2.2利用RNA干扰的方法构建IGFBP7分子表达稳定下调的MSCs细胞株。并利用Q-PCR和Western blot在m RNA水平和蛋白水平检测IGFBP7的干扰效率。2.3在体外实验中比较对照组和干扰组的MSCs细胞的增殖情况、表面标志物的表达和三向分化(成骨,成脂和成软骨)的情况。2.4利用MSCs和淋巴细胞共培养的体系研究MSCs分泌的IGFBP7是否对T细胞及其亚群的增殖和促炎因子的分泌有直接的抑制作用。利用流式细胞检测羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)荧光素的强度变化反映T细胞增殖情况;以细胞内细胞因子染色手段检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)的比例以反映MSCs对T细胞炎症因子分泌的抑制效果;2.5同时利用共培养的体系研究MSCs分泌的IGFBP7是否对T细胞及其亚群的凋亡和调节性T细胞(Tregs)有直接的促进作用。利用流式细胞检测Annexin V和PI反映T细胞的凋亡情况;利用流式细胞检测CD4+CD25+Foxp3+细胞的反映Tregs的比例变化。2.6为了阐明IGFBP7抑制T细胞增殖和促炎因子分泌的作用机制,将共培养后的T细胞用流式检测其细胞周期以及用蛋白质印迹(Western blot)的方法检测相关信号通路的蛋白表达情况。2.7利用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonicacid,TNBS)诱导,建立小鼠实验性结肠炎模型,并通过小鼠腹腔注射MSCs细胞(治疗组)或生理盐水(治疗对照组)研究MSCs的治疗效果。连续7天记录模型组与对照组的体重变化情况,观察并记录小鼠的症状以及死亡情况。小鼠解剖后将结肠取出观察和分析结肠的大体情况以及长度变化;H&E染色反映肠组织的炎症浸润程度,免疫荧光染色反映结肠组织中免疫细胞类型的变化情况。将造模后第二天的小鼠的肠系膜淋巴结(Mesenteric Lymph Nodes,MLNs)取出,直接流式细胞检测或者与MSCs体外共培养3天后再做流式细胞检测以观察IGFBP7是否在小鼠体内或者体外环境中对MLNs中的T细胞的增殖和炎症因子分泌有抑制作用。3.结果3.1 Q-PCR检测证实IGFBP7是该家族成员中在小鼠骨髓MSCs中表达最高的分子。3.2在MSCs中下调IGFBP7分子的表达未改变其表面分子的表达(如Sca-1、CD106和CD44等)、不影响小鼠MSCs的增殖速率及成骨,成脂和成软骨分化的能力。3.3体外实验中,小鼠MSCs分泌的IGFBP7能够抑制T细胞的增殖和促炎因子TNF-α和IFN-γ的分泌;不影响T细胞的凋亡和Tregs的比例。3.4 IGFBP7可以抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的激活,进而阻碍T细胞的细胞周期,使其阻滞于G0/G1期;可以抑制NF-κB信号通路的激活以抑制促炎因子的分泌。3.5动物实验中,小鼠MSCs分泌的IGFBP7可以缓解TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎的症状。包括有效抑制小鼠体重下降,提高小鼠生存率和生存质量;抑制结肠的缩短和充血水肿,降低结肠的炎症浸润程度,抑制肠道组织炎症反应。3.6小鼠MSCs可以通过IGFBP7分子显著抑制小鼠实验性结肠炎模型中MLNs内的T细胞的增殖和促炎因子TNF-α和IFN-γ的分泌,而不影响MLNs中的Tregs的比例。4.结论4.1本研究首次发现IGFBP7分子参与小鼠MSCs的免疫调节作用,表现为抑制T细胞的增殖和促炎因子的分泌。4.2 MSCs分泌的IGFBP7可以通过抑制T细胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的激活促使T细胞的细胞周期停留在G0/G1期,进而抑制其增殖;通过抑制NF-κB信号通路的激活抑制T细胞中促炎因子的分泌。4.3进一步体内实验证实,MSCs具有治疗小鼠实验性结肠炎的作用,而降低IGFBP7的表达显著抑制了MSCs的治疗作用,上述体内外研究结果证实IGFBP7在MSCs免疫调节作用中的重要角色。第二部分心脏来源的Nestin+MSCs治疗小鼠急性心肌梗死模型中的作用机制初探1.目的近年来研究显示,除骨髓外,在脂肪、脐带、肾脏、心脏等多种脏器或组织中均有MSCs的存在,并表现出类似的修复病损组织的功能。本课题组前期的研究证明,从Nestin-GFP小鼠睾丸和肾脏内来源的Nestin+睾丸和肾脏间质干细胞具有修复其靶器官的组织损伤的功能。进一步从小鼠心脏中分离得到的Nestin+细胞具有间质干细胞特性,并在修复心肌组织损伤中表现出优于骨髓Nestin+MSCs的治疗作用。但是,其治疗心肌损伤修复的作用机制尚不清楚,有待于深入阐明。2.方法2.1选取出生后7天的Nestin-GFP小鼠分离消化心脏组织,并利用流式细胞分选方法分选出GFP+的Nestin细胞并在体外无血清含有多种生长因子(如b FGF、EGF、N2、B27和CT-1)的条件下扩增培养。2.2将单个细胞接种在96孔板的1个孔中,并分别在不同的时间点(0、3、7和10天)鉴定细胞自我更新的能力。2.3在不同的分化培养基中诱导Nestin+细胞向成骨、成脂和成软骨分化。2.4利用流式细胞方法检测心脏来源的Nestin+细胞的MSCs有关的表面标志物的表达情况,包括Sca-1、c-kit、CD44、CD106、CD90、CD45和CD11b。2.5利用永久结扎小鼠左心室冠状动脉前降支的方法建立小鼠急性心肌梗死(AMI)模型,并将模型小鼠分为三组,分别在缺血区心肌内注射25μl生理盐水(Saline组)、25μl生理盐水含3×105个小鼠骨髓来源的Nestin+MSCs(Nes+MSCs组)或者心脏来源的Nestin+c MSCs(Nes+c MSCs组)。2.6在细胞治疗AMI后的1周和3周时,利用超声心动图检测小鼠心功能的各项指标,包括左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)、左心室缩短分数(Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS)、左心室舒张末期容积(Left Ventricular End-diastolic Volume,LVEDV)和左心室收缩末期容积(Left Ventricular End-systolic Volume,LVESV)等。在细胞治疗AMI后的3周,利用masson三色染色检测各组小鼠的心肌纤维化的程度。2.7利用H&E染色反映心肌内的炎症反应情况;已有文献报道巨噬细胞在AMI后的修复过程中发挥重要的功能,同时利用免疫荧光染色、流式检测、Q-PCR和酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)等方法在体外和体内实验中深入观察Nestin+c MSCs对巨噬细胞亚群的影响。2.8利用阴离子巨噬细胞去除剂去除小鼠体内的巨噬细胞后,再利用上述方法检测其对AMI模型小鼠心功能以及梗死区内免疫反应的影响。2.9利用Q-PCR检测在Nestin+c MSCs中可能参与损伤修复作用的旁分泌因子。2.10基因检测结果显示periostin基因在Nestin+c MSCs中表达。利用RNA干扰技术下调periostin的表达,且利用体外和体内实验验证periostin表达下调后的Nestin+c MSCs是否影响心肌梗死的治疗作用,以及是否对巨噬细胞转型发挥重要的作用。3.结果3.1心脏来源的Nestin+细胞具有自我更新能力,表达间质干细胞相关的表面标志物,同时具有向中胚层的骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力。因此,将这群细胞定义为心脏来源的Nestin+间质干细胞,简称Nestin+c MSCs。3.2建立小鼠急性心肌梗死模型,将3×105个心脏来源的Nestin+c MSC和骨髓来源的Nestin+MSCs心肌内注射移植于小鼠心肌梗死区。超声心动图检测显示,相比于生理盐水治疗组,Nestin+MSCs移植后1周和3周的时候可以明显增加LVEF和LVFS的值,同时显著降低LVEDV和LVESV的值;同时Nestin+MSCs明显减少心肌纤维化的程度,促进心脏的修复。而心脏来源的Nestin+c MSCs的治疗效果优于骨髓来源的Nestin+MSCs,表现为可以更加显著增加LVEF和LVFS的值,以及降低LVEDV和LVESV的值;并且改善心肌纤维化程度比Nestin+MSCs治疗组更为明显。3.3通过H&E染色发现Nestin+c MSCs可以有效的抑制AMI后心梗区内的炎症反应。已有文章报道巨噬细胞在心肌损伤的修复中扮演了重要的角色。为探讨Nestin+c MSCs治疗AMI的机制,将检测巨噬细胞的变化情况。发现Nestin+c MSCs移植可以明显减少梗死区内促炎的M1型巨噬细胞数量,并且明显增加在梗死区内抑炎的M2型巨噬细胞数量。3.4体外共培养实验结果显示Nestin+c MSCs可以抑制活化的巨噬细胞向促炎的M1型分化,促进其向抑炎型M2型巨噬细胞分化。同时抑制M1型巨噬细胞分泌促炎因子TNF-α和IFN-γ,而促进M2型巨噬细胞分泌抑炎因子IL-10。3.5利用阴离子巨噬细胞去除剂将小鼠体内的巨噬细胞清除后再输注Nestin+c MSCs,发现其治疗AMI小鼠模型的作用明显下降提示巨噬细胞数量和功能的改变可能在Nestin+c MSCs促进AMI模型小鼠心肌损伤修复中发挥了重要作用。3.6通过Q-PCR筛查发现在Nestin+c MSCs细胞中高表达巨噬细胞调节相关基因Periostin,并利用RNA干扰技术成功的下调了Periostin在Nestin+c MSCs中的表达。3.7 Periostin表达下调的Nestin+c MSCs在AMI小鼠模型中修复损伤心肌组织的能力明显下降,表现为梗死区内炎症反应没有明显改善,梗死区内M2型巨噬细胞的数量减少。3.8 Nestin+c MSCs分泌的periostin不仅增加梗死区内的M2型巨噬细胞的比例,还可以促进M2型巨噬细胞分泌抑炎因子IL-10,在AMI后的免疫抑制过程中发挥至关重要的作用。4.结论4.1心脏来源的Nestin+细胞是一群具有间质干细胞特性的细胞,因此,将这群细胞定义为心脏来源的Nestin+间质干细胞,简称Nestin+c MSCs。4.2 Nestin+c MSCs可以有效的缓解心肌梗死的症状,促进心肌的修复和心脏功能的恢复,表现为显著提高LVEF和LVFS,并明显的降低LVEDV和LVESV,同时可以减少心肌纤维化的面积,且其治疗效果优于骨髓来源的Nestin+MSCs。4.3机理研究发现,Nestin+c MSCs通过抑制进入梗死区内促炎的M1型巨噬细胞,且增加抑炎的M2型巨噬细胞的比例,从而发挥损伤修复的作用。4.4 Nestin+c MSCs分泌的periostin分子可以增加抑炎的M2型巨噬细胞的比例并通过分泌IL-10发挥抑炎的作用,从而促进心脏组织的修复并有助于心功能的改善。