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牙髓炎引起的机体免疫防御反应主要是通过龋病相关的细菌等微生物及其代谢产物导致的,并且一般是通过牙本质小管感染牙髓组织引起的。牙髓炎的免疫反应有多种免疫细胞参与,其中树突状细胞在牙髓组织的天然免疫反应中的作用最为重要。但是近年来的研究表明牙髓成纤维细胞在牙髓炎的发生发展过程中作用明显,尤其牙髓成纤维细胞中表达的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)2、3、4以及5在炎症信号通路方面的调节作用等被国内外学者所关注。TLRs是细胞膜表面最常见的一类受体蛋白分子,它可以发现入侵的外源性病源分子包括病原相关分子模式(pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs)和危险相关分子模式(damage Associated Molecular Patterns,DAMPs),启动和调控炎症发生、发展和转归的愈合过程。其中TLR4分子是识别内毒素,参与炎症发生发展的重要受体分子。我们前期的研究发现在LPS刺激人牙髓成纤维细胞后,TLR4、My D88、NF-κB信号通路对NLRP3和IL-1β两种基因具有转录调节作用,但是其具体机制尚不明了。随着人们生活节奏的加快、压力增加,由睡眠障碍导致各种炎性相关疾病发生率增加,褪黑素(melatonin,MT)具有促进睡眠、调节免疫等重要功能,可以降低巨噬细胞以及其他的免疫细胞中TLR4、NF-κB的信号通路的表达,但是褪黑素对牙髓炎调节免疫作用及相关机制尚无相关报道。本实验通过建立体内外牙髓炎症模型,并施加褪黑素药物干预研究TLR4、NF-κB信号通路的变化,阐明褪黑素、TLR4、NF-κB信号通路与牙髓组织固有免疫的关系,为寻找牙髓炎症新的治疗方法奠定基础。研究内容:1.大鼠牙髓炎模型的建立以及相关炎性因子IL-1β、TNF-α、褪黑素和TLR4、NF-κB的信号通路激活在牙髓炎发生过程中的作用2.褪黑素对牙髓炎相关炎性因子IL-1β、TNF-α和TLR4、NF-κB的信号通路调节机制3.褪黑素受体在人牙髓成纤维细胞中的表达及与在牙髓炎中的作用方法:1.大鼠磨牙开髓法建立大鼠牙髓炎模型,HE染色确定牙髓炎的状况,RT-PCR检测牙髓中TLR4、NF-κB相关基因的表达水平,免疫组化观察TLR4、NF-κB在牙髓中的表达情况,ELISA检测血清中IL-1β、IL-18、TNF-α、褪黑素浓度以及牙髓中IL-1β和TNF-α的浓度。2.构建大鼠牙髓炎模型,通过腹腔注射褪黑素施加药物干预措施后,ELISA检测牙髓中IL-1β和TNF-α的浓度,RT-PCR和免疫组化检测牙髓中TLR4、NF-κB相关基因的表达水平。体外构建人牙髓细胞牙髓炎模型,施加褪黑素干预后,RT-PCR检测TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA表达水平,western-blot检测TLR4、NF-κB蛋白表达水平,ELISA检测细胞中IL-1β及TNF-α的浓度。3.应用RT-PCR和免疫组化检测人牙髓细胞中褪黑素受体的表达,通过慢病毒介导的RNAi技术特异性的减低褪黑素受体的表达,LPS刺激人牙髓细胞,再施加褪黑素干预后,RT-PCR检测TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA表达水平,western-blot检测TLR4、NF-κB蛋白表达水平,ELISA检测细胞中IL-1β及TNF-α的浓度。结果:1.成功建立大鼠牙髓炎模型,牙髓炎后血清中IL-1β、IL-18、TNF-α表达水平升高及牙髓组织中IL-1β、TNF-α表达水平升高,血清中褪黑素含量先降低后升高;免疫组化结果显示TLR4、NF-κB在炎症部位表达量升高;牙髓组织中TLR4、NF-κB蛋白m RNA表达水平升高。2.与单纯牙髓炎组相比,腹腔注射褪黑素后牙髓炎牙髓组织中IL-1β、TNF-α表达水平明显下降;TLR4、NF-κB在炎症部位表达量明显下降;牙髓组织中TLR4、NF-κB蛋白m RNA表达水平明显下降。与单纯LPS刺激牙髓炎组比较,LPS刺激人牙髓细胞再施加褪黑素干预后牙髓细胞中IL-1β、TNF-α表达水平明显下降;TLR4、NF-κB在细胞中表达量明显下降;牙髓细胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白m RNA表达水平显著下降。3.人牙髓细胞中MT1表达阳性,MT2几乎无法检测到,MT1被特异性的干扰后,褪黑素对于牙髓炎的抑制作用明显减低,与MT1表达水平正常的牙髓炎组比较,LPS+褪黑素+MT1表达抑制组的人牙髓细胞中IL-1β、TNF-α表达水平明显上升;TLR4、NF-κB在细胞中表达量明显上调;牙髓细胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白m RNA表达水平明显上调。结论:1.大鼠牙髓炎后血清IL-1β、TNF-α、IL-18及牙髓组织中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌都明显升高但血清褪黑素含量下降。2.褪黑素可以抑制大鼠牙髓炎过程牙髓组织中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌;褪黑素可以抑制LPS刺激人牙髓成纤维细胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌。3.褪黑素抑制人牙髓成纤维细胞炎症过程可能是通过褪黑素受体MT1发挥作用的。