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食品安全已经成为全世界共同关注的公共卫生问题。在各种食品安全事件中,由细菌引起的食源性疾病最多,涉及人数最广。沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌0157：H7被认为是牛肉中最重要的三种食源性致病菌。可靠的检测技术是确定食物中病原菌的先决条件。传统培养法操作繁琐(富集、分离、鉴定),检测时间较长,已经不能满足食品中致病菌快速灵敏检测的需要,以核酸为基础的多重PCR是一种快速、高灵敏度、特异性较强的检测方法,能同时检测多种食源性致病菌,有着广泛的应用前景。本文对多重PCR法检测牛肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌0157：H7三种致病菌进行了研究。本研究通过预实验筛选出种或属间特异性引物,并对其进行特异性检测。选用广泛存在于沙门菌属的侵袭蛋白基因invA作为检测沙门菌属的特异性基因；选用hlyA基因作为单增李斯特菌的毒力标志基因；选用大肠杆菌0157的O抗原基因(rfbE)和鞭毛抗原基因(flic),建立了同时检测三种食源性致病菌的多重PCR方法。在引物特异性实验中,四对引物分别扩增出大小为284bp、456bp、625bp、812bp的条带。各目的基因及引物间没有干扰,而其它非靶菌没有非特异性扩增现象,证明引物具有很高的特异性。对多重PCR体系中的Taq酶、dNTP、引物浓度、Mg2+和退火温度进行优化,最终确定多重PCR反应体系为25μL:Mg2+4mmol/L, dNTP0.4mmol/L, Taq DNA聚合酶0.5U,1μLDNA模板,沙门氏菌的引物终浓度为0.2μmol/L,单增李斯特菌引物终浓度为0.1μmol/L,大肠杆菌0157：H7引物终浓度为1μmol/L (flic)和0.3μmol/L(rfbE),剩下的用无菌水补至25μL。多重PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,进行35个循环；最后72℃延伸7min。在最佳实验条件下,多重PCR同时检测三种食源性致病菌,沙门氏菌和单增李斯特菌灵敏度为101CFU/mL,大肠杆菌0157：H7灵敏度为102CFU/mL;人工污染牛肉样品经18h富集培养后,沙门氏菌、大肠杆菌0157：H7的检出限为100CFU/g,单增李斯特菌的检出限为102CFU/g。通过比较试剂盒法、酚氯仿法和直接水煮法提取人工污染牛肉中三种致病菌的DNA,由电泳结果可知,试剂盒法的DNA提取效果明显优于酚氯仿法、直接水煮法。对比TSB和LB两种增菌培养基的增菌效果,选出使三种目标致病菌同时增菌的培养基。用LB增菌培养基进行前增菌,最低可同时检出102CFU/g的三种致病,用TSB增菌培养基进行前增菌,最低可同时检出103CFU/g的三种致病。因此,选用LB作为三种致病菌的通用增菌培养基。对实际样品进行检测,并与国标法进行对比,结果表明,采用多重PCR方法简单、快速,能同时检测出牛肉中的一种或多种致病菌,具有较高的灵敏性、特异性和符合率。本研究建立的检测牛肉样品中的沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌0157：H7的多重PCR方法,为这三种病原菌的控制奠定了一定的基础。