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目 的 HBV具备改造作为肝靶向性基因治疗载体的基本条件：天然嗜肝特异性；能够在肝细胞内持续复制、反复感染，病毒本身对细胞无明显细胞毒性；能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒，介导目的基因转移和表达。但因基因结构复杂，目前改造的HBV载体系统均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点。基于此，本课题借鉴体内天然HBV变异株的生物学特性，优化HBV载体改造策略，探索性构建C基因截短型HBV载体，并对其表达、复制、包装等分子生物学特性进行探讨。 方 法1. 用外源GFP报告基因取代野生HBV质粒pHBV3091 S基因编码区，同时保留S基因前9个碱基与GFP融合，构建携带外源报告基因的HBV载体pHBV-S-GFP。应用脂质体单独转染该HBV重组体，以GFP表达阳性质粒pCMV-GFP作对照，荧光显微镜下观察GFP在肝细胞中表达。重组体pHBV-S-GFP与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞，提取细胞核中病毒DNA，根据HBV 基因组复制特点设计包含GFP及HBV DNA序列在内的特异性引物，半巢式PCR检测HBV重组体复制中间体ccc DNA的生成；提取胞外上清液中病毒颗粒DNA，对同一样本依次PCR检测GFP基因及HBV DNA，验证分泌到上清液中携带外源基因的“治疗性”子代病毒颗粒生成；Southern blot检测重组HBV载体的包装效率，并与野生HBV质粒对照组进行比较。以野生型HBV质粒pHBV3091为骨架，通过基因定点突变技术构建C基因截短型HBV突变体：pHBV-CΔ188（缺失220-407nt）和pHBV-CΔ141（缺失267-407nt）。应用脂质体单独转染或与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞，提取细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot，检测C基因截短型HBV突变体的复制包装能力；提取细胞核中病毒DNA，根据HBV 基因组复制特点设计特异性引物，PCR检测C基因截短型HBV突变体复制中间体ccc DNA的生成；通过实时荧光定量PCR对胞外上清液中病毒颗粒进行定量分析，比较C基因截短型HBV突变体与野生型HBV的包装效率。以野生HBV质粒pHBV3091<WP=12>2. 作对照，单独转染C基因截短型HBV突变体质粒，Trizol法提取转染细胞总RNA，荧光定量RT-PCR定量分析C基因截短对HBV RNA转录水平的影响；提取细胞浆中病毒颗粒，Western blot检测S蛋白的表达，ELISA方法定量分析C基因截短对S蛋白表达的影响。3. 用外源GFP报告基因取代HBV S基因编码区（同方法1），构建C基因截短型（同方法2）HBV载体：pHBVΔC188-S-GFP与pHBVΔC141-S-GFP。应用脂质体分别转染HepG2细胞，以C基因非截短型HBV载体pHBV-S-GFP质粒作阳性对照，荧光显微镜下观察细胞中GFP表达。与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞，提取细胞核中病毒DNA，根据HBV 基因组复制特点设计同时包含GFP基因及HBV DNA序列在内的特异性引物，半巢式PCR检测该类HBV重组体复制中间体ccc DNA的生成；提取细胞浆中病毒颗粒进行病毒包装实验，验证C基因截短型HBV载体的包装能力：非变性 Western blot检测病毒颗粒的C蛋白， Southern blot检测C蛋白包裹的DNA；提取胞浆中病毒颗粒DNA，常规Southern blot后对杂交信号进行扫描，定量分析C基因截短型HBV载体的包装效率；提取上清液中病毒DNA，设计同时包含GFP基因片段及HBV DNA序列在内的特异性引物，PCR验证携带外源基因的“治疗性”子代病毒颗粒分泌到胞外上清液中。结 果1. 外源GFP报告基因取代HBV S基因读码框破坏了P基因结构的完整性，因此重组体pHBV-S-GFP自身复制能力丧失，为复制缺损型载体。单独转染HepG2细胞后，可在蓝光（488nm）激发下发出绿色荧光，但荧光强度相对弱于阳性对照。与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染肝细胞，可在细胞核提取物中检测到含有GFP基因的HBV复制中间体ccc DNA生成；常规PCR检测发现，携带GFP基因的子代病毒颗粒能够分泌到胞外上清液中；进一步Southern blot证实，pHBV-S-GFP/ pHBV3142共转染后病毒包装效率明显低于野生HBV质粒pHBV3091。HBV突变体pHBV-CΔ141 与pHBV-CΔ188的C基因截短变异均发生在P基因读码框5’近端附近，但P基因结构没有受到影响。其中前者为模拟体内天然变异株的基因结构构建，后者则在前者基础上进一步将C基因截短延长到Δ188nt。两者分别单独转染HepG2细胞，提取胞浆及上清液中病毒DNA进行Southern blot，杂交结果均阴性；后分别与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染肝细胞，提取胞浆及上清液中病毒DNA<WP=13>2. 进行Southern blot，两者杂交结果均阳性，可见到HBV DNA各种复制中间体杂交信号：如RC DNA、DS DNA、SS DNA等；通过特异性PCR可在细胞核内检测到HBV变异体ccc DNA的生成；与pHBV3091/pHBV3142转染组相比，C基因截短型HBV突变体的Southern blot杂交信号显著增强；进一步对培养上清液中子代病毒颗粒DNA进行定量：pHBV-CΔ188 / pHBV3142组为2.2×109copies/ml、pHBV-CΔ141 / pHBV3142组为1.5×108copies/ml、pHBV3091 / pHBV3142为4.8×107 copies/ml，提示C基因截短型HBV突变体的包装效率显著提高，其中C基因截短188nt后效果更为明显；荧光定量RT-PCR显示，C基因截短对HBV RNA的转录水平没有影响?