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目 的 HBV具备改造作为肝靶向性基因治疗载体的基本条件:天然嗜肝特异性;能够在肝细胞内持续复制、反复感染,病毒本身对细胞无明显细胞毒性;能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒,介导目的基因转移和表达。但因基因结构复杂,目前改造的HBV载体系统均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点。基于此,本课题借鉴体内天然HBV变异株的生物学特性,优化HBV载体改造策略,探索性构建C基因截短型HBV载体,并对其表达、复制、包装等分子生物学特性进行探讨。 方 法1. 用外源GFP报告基因取代野生HBV质粒pHBV3091 S基因编码区,同时保留S基因前9个碱基与GFP融合,构建携带外源报告基因的HBV载体pHBV-S-GFP。应用脂质体单独转染该HBV重组体,以GFP表达阳性质粒pCMV-GFP作对照,荧光显微镜下观察GFP在肝细胞中表达。重组体pHBV-S-GFP与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞,提取细胞核中病毒DNA,根据HBV 基因组复制特点设计包含GFP及HBV DNA序列在内的特异性引物,半巢式PCR检测HBV重组体复制中间体ccc DNA的生成;提取胞外上清液中病毒颗粒DNA,对同一样本依次PCR检测GFP基因及HBV DNA,验证分泌到上清液中携带外源基因的“治疗性”子代病毒颗粒生成;Southern blot检测重组HBV载体的包装效率,并与野生HBV质粒对照组进行比较。以野生型HBV质粒pHBV3091为骨架,通过基因定点突变技术构建C基因截短型HBV突变体:pHBV-CΔ188(缺失220-407nt)和pHBV-CΔ141(缺失267-407nt)。应用脂质体单独转染或与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞,提取细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot,检测C基因截短型HBV突变体的复制包装能力;提取细胞核中病毒DNA,根据HBV 基因组复制特点设计特异性引物,PCR检测C基因截短型HBV突变体复制中间体ccc DNA的生成;通过实时荧光定量PCR对胞外上清液中病毒颗粒进行定量分析,比较C基因截短型HBV突变体与野生型HBV的包装效率。以野生HBV质粒pHBV3091<WP=12>2. 作对照,单独转染C基因截短型HBV突变体质粒,Trizol法提取转染细胞总RNA,荧光定量RT-PCR定量分析C基因截短对HBV RNA转录水平的影响;提取细胞浆中病毒颗粒,Western blot检测S蛋白的表达,ELISA方法定量分析C基因截短对S蛋白表达的影响。3. 用外源GFP报告基因取代HBV S基因编码区(同方法1),构建C基因截短型(同方法2)HBV载体:pHBVΔC188-S-GFP与pHBVΔC141-S-GFP。应用脂质体分别转染HepG2细胞,以C基因非截短型HBV载体pHBV-S-GFP质粒作阳性对照,荧光显微镜下观察细胞中GFP表达。与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞,提取细胞核中病毒DNA,根据HBV 基因组复制特点设计同时包含GFP基因及HBV DNA序列在内的特异性引物,半巢式PCR检测该类HBV重组体复制中间体ccc DNA的生成;提取细胞浆中病毒颗粒进行病毒包装实验,验证C基因截短型HBV载体的包装能力:非变性 Western blot检测病毒颗粒的C蛋白, Southern blot检测C蛋白包裹的DNA;提取胞浆中病毒颗粒DNA,常规Southern blot后对杂交信号进行扫描,定量分析C基因截短型HBV载体的包装效率;提取上清液中病毒DNA,设计同时包含GFP基因片段及HBV DNA序列在内的特异性引物,PCR验证携带外源基因的“治疗性”子代病毒颗粒分泌到胞外上清液中。结 果1. 外源GFP报告基因取代HBV S基因读码框破坏了P基因结构的完整性,因此重组体pHBV-S-GFP自身复制能力丧失,为复制缺损型载体。单独转染HepG2细胞后,可在蓝光(488nm)激发下发出绿色荧光,但荧光强度相对弱于阳性对照。与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染肝细胞,可在细胞核提取物中检测到含有GFP基因的HBV复制中间体ccc DNA生成;常规PCR检测发现,携带GFP基因的子代病毒颗粒能够分泌到胞外上清液中;进一步Southern blot证实,pHBV-S-GFP/ pHBV3142共转染后病毒包装效率明显低于野生HBV质粒pHBV3091。HBV突变体pHBV-CΔ141 与pHBV-CΔ188的C基因截短变异均发生在P基因读码框5’近端附近,但P基因结构没有受到影响。其中前者为模拟体内天然变异株的基因结构构建,后者则在前者基础上进一步将C基因截短延长到Δ188nt。两者分别单独转染HepG2细胞,提取胞浆及上清液中病毒DNA进行Southern blot,杂交结果均阴性;后分别与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染肝细胞,提取胞浆及上清液中病毒DNA<WP=13>2. 进行Southern blot,两者杂交结果均阳性,可见到HBV DNA各种复制中间体杂交信号:如RC DNA、DS DNA、SS DNA等;通过特异性PCR可在细胞核内检测到HBV变异体ccc DNA的生成;与pHBV3091/pHBV3142转染组相比,C基因截短型HBV突变体的Southern blot杂交信号显著增强;进一步对培养上清液中子代病毒颗粒DNA进行定量:pHBV-CΔ188 / pHBV3142组为2.2×109copies/ml、pHBV-CΔ141 / pHBV3142组为1.5×108copies/ml、pHBV3091 / pHBV3142为4.8×107 copies/ml,提示C基因截短型HBV突变体的包装效率显著提高,其中C基因截短188nt后效果更为明显;荧光定量RT-PCR显示,C基因截短对HBV RNA的转录水平没有影响?