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人类免疫缺陷病毒(HIV),是逆转录病毒科慢病毒属灵长类慢病毒亚属中的一类病毒。据全国两次分子流行病学调查结果表明HIV CRF01 AE重组型株正在从南部及沿海省市向周围省市扩散,CRF01 AE重组型在全国所占比例也有所增加,在福建省HIV CRF01 AE重组型为主要的流行株。本研究首次在国内开展了HIV CRF01 AE流行株的表型分析、全长膜基因的特征和表达、全长基因的特征和感染性克隆构建的研究,为本型病毒的病原学、变异特征、疫苗、诊断方法和致病机理的研究提供了坚实的基础。
一.福建省HIV-1 CRF01 AE感染者的病毒分离及其生物学表型初步研究
1.成功分离4份HIV-1 CRF01_AE感染者的毒株,Fj200604在MT-2细胞诱导了典型的合胞体(SI),另外3个毒株没有形成明显的合胞体(NSI):分离株Fj200601-Fj200603利用CCR5辅助受体,Fj200604利用CXCR4辅助受体。
2.分离株的生物学表型与V3环序列变异密切相关,表明通过对V3环关键氨基酸的分析可以预测HIV-1辅助受体的使用情况。
二.福建省HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长gp120基因序列特征分析
1.基因系统树分析显示本研究所有的样本属于HIV-1 CRF01_AE重组型,遗传变异较大,组内基因距离为9.5±2.5%。
2.V3环顶端四肽存在四种类型:GPGQ(72.24%),GPGR(19.04%),GPGH(4.76%),GQGQ(4.76%)。16份(76.19%)样本可能使用CCR5作为辅助受体,1份(4.76%)样本可能使用CCR5/CXCR4受体,4份样本(19.04%)不能做出预测。
3.C1-C5区比较保守,而V1-V5环变化较大,其中V3相对保守。
4.N糖基化位点分析发现大多数位点较为保守,少数糖基化位点发生丢失和增加。
三.HIV膜蛋白gp120基因在果蝇S2细胞中的表达
1.构建了全长gp120基因和缺失V1/V2环的表达重组载体,在果蝇S2细胞中瞬时表达成功。
2.建立了稳定表达的筛选方法,筛选了稳定分泌表达全长gp120基因和缺失V1/V2环的重组果蝇S2细胞。
四.福建省13条HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长基因克隆及其序列特征分析
1.完成了13株HIV-1 CRF01 AE全基因组克隆,建立了HIV-1CRF01 AE全基因组扩增平台。
2.13条全基因组克隆测序提交至NCBI(美国国家生物信息数据库)的GenBank。
3.系统进化树分析表明所有13条全长基因序列与CRF01 AE参考株聚在一起,但可分成几个亚组分散在泰国分离株中。13条全长基因序列(去除超突变序列Fj061)env,gag,pol三个结构基因区的组内基因离散率均高于泰国分离株:全长基因序列Fj061证实为超突变序列。所克隆序列未出现基因水平的重组,对蛋白酶和逆转录酶的药物依然敏感。
五.福建省CRF01 AE重组型感染性克隆的构建和生物学活性初步鉴定
1.完成3个全长克隆的连接,293T细胞转染实验表明2个全长克隆(全长克隆A和嵌合全长克隆A-B)显示较好的活性。
2.全长克隆A和嵌合全长克隆A-B具有一定程度的感染PBMCs的能力和在PBMCs内进行有效复制的能力,而嵌合全长克隆A-B在PBMCs中的复制能力比全长克隆A更强些。
3.嵌合全长克隆A-B应用CCR5作为辅助受体,而全长克隆A未观察到细胞对辅助受体的利用情况。