β-葡萄糖苷酶是三种纤维素酶之一，在纤维素降解中起决定性作用，可将纤维二糖和可溶性纤维寡糖水解成葡萄糖分子及相应的配基。在食品风味的改善、保健品的开发、纤维素的分解、疾病的检测和药物的研制等方面具有重大的应用价值。但目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶绝大部分来自木霉等真菌，对温度和pH等条件适应范围较窄，而且酶活力也偏低，导致生产和使用成本较高，这已成为当前β-葡萄糖苷酶广泛应用的瓶颈。为获得酶活力高且酶学特性优良的β-葡萄糖苷酶，本研究用台湾乳白蚁肠道微生物群落构建了高质量的宏基因组文库，并利用功能筛选法从文库中筛选到一个具有较高酶活力的克隆子。通过DNA序列测定及分析发现，该克隆子插入片段全长5415bp，含有两个编码β-葡萄糖苷酶的基因bgl1923和bgl1392。两个基因有4个碱基重合，全长3311bp。重组表达结果显示，bgl1923和bgl1392单独表达时均无β-葡萄糖苷酶活性，只有两者作为一个整体（基因bgl3311）同时表达时才表现出高的β-葡萄糖苷酶活性。这种由两个基因相互作用才能显示β-葡萄糖苷酶酶活性的特性在以前尚未被报道过，对研究β-葡萄糖苷酶的分子结构以及来自不同结构域的蛋白质分子间的相互作用等有重要意义。对bgl1923和bgl1392进行同源性分析，结果显示bgl1923与Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM来源的β-葡萄糖苷酶基因有84%的相似性，而bgl1392与白蚁Reticulitermes santonensi后肠未知微生物富集培养筛选到的β-葡萄糖苷酶基因P11-6B有70%的相似性。利用高保真PCR技术扩增基因bgl3311，并与原核表达载体pET-32a（+）构建重组质粒，转化原核表达菌株E.coli BL21（DE3）进行重组表达。为了获得最佳的表达效果，优化了重组酶的诱导表达条件。结果显示，当诱导前菌体浓度OD600=0.8时，使用终浓度为1.0mM IPTG，于25℃诱导16h，此时重组酶的表达量达到最高,达8.55U/ml。对重组酶酶学性质进行了测定，酶促反应的最适pH和最适温度分别是pH6.8和51℃。以pNPG为底物时其Km值为0.290mM，Vmax为573μM/min，以纤维二糖为底物时其Vmax=816μM/min，Km=0.134mM。测定了1mM和10mM不同金属离子对酶活力的影响，Li+、Na+和K+对酶活力均有促进作用；作为常见金属活性中心的Mn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺和Fe³⁺均未表现出对酶活力的促进作用，相反地还随浓度增高抑制了酶的活力，Mg²⁺的抑制效果尤其显著；另外，重金属离子Ag⁺、Hg²⁺对酶活力有强烈抑制作用，Ca²⁺和Co²⁺对酶活性也有较强的抑制作用。作为典型的蛋白变性剂，SDS和EDTA对酶活力有强烈的抑制作用，盐酸胍和异硫氰酸胍在高浓度时才会显示出抑制作用，尿素在低浓度时对酶活力有促进作用，高浓度时则促进作用消失。此外，Bgl3311显示了较强的丙酮、咪唑和尿素的耐受性。葡萄糖作为酶促反应的产物，对酶的活性有较大影响，随葡萄糖浓度的增加，Bgl3311的酶活力直线降低。但葡萄糖浓度高达1.5M时，酶依然能保持最高酶活力的64.5%，显示出Bgl3311对葡萄糖有较好的耐受性。令人感兴趣地是，在葡萄糖浓度低于1M时，葡萄糖的存在还能大幅提高酶的热稳定性。当NaCl浓度低于0.8M时，对酶的活力有显著的促进作用，但当NaCl浓度超过0.8M后开始对酶的活力产生抑制作用，且随浓度增加抑制作用急剧增加。当NaCl浓度达到3M时，酶的活力几乎完全消失。由于筛选得到的β-葡萄糖苷酶Bgl3311酶活不够高，因此我们采用分子定向进化技术对其进行了改造。通过易错PCR方法构建了随机突变文库，以pNPG为底物，酶活力为筛选指标，最终获得酶活力提高的突变酶Bglm0326。经核酸序列比对，有三个碱基发生突变，导致有2个氨基酸发生了替换，突变位点分别是S556A和H860L，另一个为同义突变（T446T）。与野生型β-葡萄糖苷酶相比较，突变酶的酶活性提高了2.6倍（以pNPG为底物），达到22.24U/ml。上述结果表明，在提高β-葡萄糖苷酶酶活力方面，借助于易错PCR的蛋白质定向进化技术是一种行之有效的方法。综上所述，本论文成功构建了高质量的台湾乳白蚁肠道微生物宏基因组文库，并从中筛选到一个作用机制非常特殊的β-葡萄糖苷酶基因，对其进行了原核重组表达，对重组酶的酶学特性进行了测定，然后利用易错PCR技术对酶进行了定向进化方面的探索。研究结果对于今后丰富纤维素酶的来源，定向拓展酶的应用条件以及促进未培养微生物中纤维素酶的基础和应用研究等方面都具有重要的意义。