目的:骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）,也称为退行性骨关节病,是一种慢性进行性疾病,其特征在于主要病理特征的退行性变化。这些包括关节软骨变性,软骨下骨侵蚀和滑膜炎症。主要临床症状包括疼痛,僵硬和活动受限。随着人口老龄化,OA的发病率逐年增加。目前,OA的发病机制和发病机制尚不明确,但可以肯定的其发病机制是由多种因素综合作用的。机械压力刺激与软骨细胞的生长状态有关,在一定程度上可以改变软骨的形态和组成。OA导致关节软骨的破坏,滑膜的炎症和软骨下骨的变化。慢性炎症是骨性关节炎的危险因素之一。近几年关于脂肪组织产生的脂质因子所参与的低强度的炎症反应被广泛关注。而炎症因子会引起关节的进一步损伤。脂氧素A₄（lipoxin A₄,LXA₄）是细胞-细胞互相作用过程中产生的类二十烷酸,并且是炎症的终止信号。作为近年来研究的抗炎介质,它在慢性炎症中起着至关重要的作用。OA的进展与关节内的慢性炎症密切相关。LXA₄能刺激滑膜成纤维细胞并合成抑制炎性因子和基质金属蛋白酶（MMPs）,从而进一步缓解OA。运动不仅可以作用于关节软骨细胞,还包括关节滑膜成纤维细胞的改变。然而在运动治疗OA中,对滑膜成纤维细胞的影响机制研究很少。LXA₄可通过激活钙受体以调控胞内的Ca²⁺的内流。同时,适当的压力刺激将增加滑膜成纤维细胞中ATP的消耗并增加AMP含量。这两种信号分子均会激活滑膜成纤维细胞内AMPK（AMP-activated protein kinase）通路。AMPK作为能量代谢的主要通路可调节能量平衡。胞内的能量代谢能够调控炎症反应,反过来,炎症反应本身也会调控细胞的能量代谢。激活的AMPK通路可以导致NF-κB p65蛋白酶体的降解从而抑制NF-κB通路。研究表明AMPK通路可以抑制由IL-1β和TNF-α所引起的NF-κB通路的激活。其可以进一步抑制滑膜本身的炎症和MMP的形成,从而保护关节软骨。在前期研究基础上,本课题通过跑台训练OA大鼠,研究不同运动负荷下LXA₄的升高程度与OA软骨损伤的相关性,探究不同状况下运动负荷对LXA₄代谢的影响。并应用LXA₄受体拮抗剂（BOC-2）,明确LXA₄在运动治疗OA中发挥的作用。在此基础上进一步以LXA₄为切入点,研究运动对OA的治疗机制。本实验小组选择滑膜成纤维细胞及软骨细胞培养。通过加入LXA₄及flexcell?细胞应力加载系统,观察对滑膜成纤维细胞及软骨细胞AMPK/NF-κB通路的影响,揭示LXA₄在运动刺激下的生成及调节途径,阐明运动治疗OA的机制,将运动治疗OA的机制引向深入。在保证LXA₄升高的情况下尽可能减少过度压力的刺激,为制定各种合理运动提供更有效检测指标。研究方法:1.研究正常大鼠在单次不同跑台训练后,血清及膝关节腔内灌洗液LXA₄水平随不同时间点的变化趋势:材料选用SD大鼠进行研究,分别进行不同强度、不同时间的跑台训练后用ELISA的方法检测血清以及关节腔内灌洗液中LXA₄含量随时间的变化。2.SD大鼠膝关节OA模型的建立:通过关节腔内注射50μL含有1.0 mg碘乙酸（monosodium iodoacetate,MIA）制备大鼠的OA模型。3.根据其不同运动方式下LXA₄的变化趋势,设计不同的跑台训练:（1）设计相同运动量,中等训练强度,不同周期的跑台训练;（2）设计不同运动强度的跑台训练。4.各组大鼠膝关节OA的评价:（1）各组大鼠膝关节大体观察评价;（2）各组膝关节组织切片后进行HE及甲苯胺蓝染色;并进行OARSI及改良的Mankin评分。5.各组大鼠膝关节软骨及滑膜组织相关蛋白的表达检测:（1）采用western-blot方法检测各组软骨及滑膜组织相关蛋白的表达;（2）采用免疫组化的方法检测各组软骨及滑膜组织相关蛋白的表达;（3）采用qPCR方法检测各组软骨及滑膜组织相关蛋白的表达。6.进行软骨细胞及滑膜成纤维的细胞的原代培养,体外模拟OA的炎症刺激。7.LXA₄对IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞的作用及相关通路蛋白的检测:选取3-5代原代培养的滑膜成纤维细胞,用MTT选取适合的IL-1β浓度进行诱导。再使用LXA₄,观察对IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞的作用及相关通路蛋白的检测。在此基础上加入BOC-2观察LXA₄的作用效果。8.flexcell?细胞应力加载系统对IL-1β诱导的软骨细胞AMPK/NF-κB通路的作用:（1）通过高谱液相的方法检测软骨细胞ATP,ADP及AMP的变化;（2）通过fluo-3AM对细胞内钙离子染色,流式细胞仪及免疫荧光的方式进行检测;（3）通过western-blot及qPCR的方法检测AMPK,p-AMPK,MMP-13,IκB-α,COLⅡ等相关蛋白及mRNA的表达。（4）通过免疫荧光的方法检测NF-κB p65入核的情况。结果:1.正常大鼠在单次不同跑台训练后,血清及膝关节腔内灌洗液LXA₄水平随不同时间点的变化趋势（1）通过ELISA检测不同时间（20min,30min以及60min）相同强度跑台训练后SD大鼠血清及关节腔灌洗液中LXA₄的水平均升高。并且在运动2小时内升高,4小时后恢复到正常水平。（2）通过ELISA检测不同时间（20min,30min以及60min）相同强度跑台训练后SD大鼠血清及关节腔灌洗液中LXA₄的水平在各组之间无明显差异。（3）通过ELISA检测不同强度（低、中及高等运动强度）相同时间跑台训练后SD大鼠血清及关节腔灌洗液中LXA₄的水平均升高,低等强度与中等强度相比有统计学差异,但中等强度与高等强度相比较无明显差异。2.膝关节OA模型的评价（1）大鼠膝关节大体进行评估发现:正常对照组大鼠膝关节表面软骨光滑,色泽鲜艳,无破坏。但在OA模型（注射MIA后4-8周的时间）,发现软骨灰暗,出现软骨破坏,并随着注射时间的延长,软骨的缺损更加严重。（2）HE及甲苯胺蓝染色发现:正常组的关节钙化的软骨（潮线）完整,软骨也相对完整。在OA模型（注射MIA后4-8周的时间）发现关节钙化的软骨破坏,表面不平出现裂隙,甲苯胺蓝染色失染,随着注射时间的延长,染色失染更加明显。进行OARSI及Mankin评分发现,OA模型组与正常组之间有明显的统计学差异。3.根据其不同运动方式下LXA₄的变化趋势,设计不同的跑台训练（1）运动总时间一致情况下进行不同运动周期的跑台训练。OAE3（日三次）与OAE2（日二次）和OAE1（日一次）相比较,OARSI及Mankin评分均具有统计学差异,并且软骨相关的蛋白的表达也与组织切片的改变一致,并存在统计学意义。（2）相同运动时间,不同运动强度的跑台训练。研究结果发现中等强度的跑台训练可以缓解OA软骨的破坏及甲苯胺蓝的失染。并且OARSI及Mankin评分发现中等运动强度与OA组相比存在统计学差异。（3）选取中等运动强度,并在此基础上腹腔注射BOC-2（LXA₄受体拮抗剂）。OARSI及Mankin评分发现注射BOC-2组与中等强度跑台训练组比较有明显统计学差异。并且通过western-blot,qPCR,免疫组化等方法检测相关蛋白的表达趋势与病理切片的改变一致,结果具有统计学差异。4.LXA₄对IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞的作用及相关通路蛋白的检测（1）选取3-5代原代培养的滑膜成纤维细胞,根据MTT的实验结果发现使用1 ng/ml的IL-1β具有统计学差异。（2）LXA₄（1nM）作用于IL-1β（1 ng/ml）诱导的滑膜成纤维细胞,通过western-blot方法发现LXA₄可以减少MMP-3以及MMP-13的蛋白表达。（3）LXA₄（1nM）作用于IL-1β（1 ng/ml）诱导的滑膜成纤维细胞,通过免疫荧光方法发现LXA₄可以抑制IL-1β引起的NF-κB p65入核。（4）在加入LXA₄（1nM）基础上,再加入BOC-2（1nM）,通过western-blot方法发现BOC-2可以增加MMP-3以及MMP-13的蛋白表达。（5）在加入LXA₄（1nM）基础上,再加入BOC-2（1nM）,通过免疫荧光方法发现BOC-2可以增加NF-κB p65入核。5.flexcell?细胞应力加载系统对IL-1β诱导的软骨细胞AMPK/NF-κB通路的作用（1）研究flexcell?细胞应力加载系统（CTS,0.5Hz,10%）不同时间作用于IL-1β诱导的软骨细胞,通过western-blot检测COLⅡ的含量发现4h和8h的CTS与IL-1β诱导的软骨细胞相比较具有统计学差异,但4h与8h的CTS之间比较,无明显统计学差异。（2）研究flexcell?细胞应力加载系统（CTS,0.5Hz,10%）不同时间作用于正常的软骨细胞,通过western-blot检测COLⅡ的含量发现0,2h,4h,8h,16h以及24h各组细胞间无明显的统计学差异。（3）通过高谱液相（HPLC）检测4h的CTS,软骨细胞的ATP,ADP以及AMP的含量,发现拉伸前后AMP含量明显升高,ATP的含量明显降低,并具有统计学差异。（4）通过wester-blot检测4h的CTS,发现软骨细胞胞浆内的AMPK,p-AMPK,MMP-13,IκB-α以及核内的NF-κB p65蛋白的表达具有统计学差异。（5）通过免疫荧光检测4h的CTS,软骨细胞的NF-κB p65入核情况,发现CTS可以抑制IL-1β引起的NF-κB p65入核。结论:1.在进行跑台训练后,大鼠血清及关节腔灌洗液中LXA₄的水平在2h明显升高,并在4h后恢复到正常水平,说明LXA₄是快速生产,快速代谢的产物;在中等运动强度,随着运动时间的增加,LXA₄在不同时间点变化的水平无明显差异;而在相同运动时间,随着运动强度的增加LXA₄的水平也逐渐升高,但在运动强度达到一定程度后,LXA₄在不同时间点变化的水平无明显差异。2.在相同运动量,中等运动强度,不同运动周期的跑台训练中,日三次的跑台训练具有较好的治疗效果。同时,根据LXA₄随不同跑台训练的结果提示LXA₄在其中起到一定作用。3.在不同运动强度的跑台训练中,中等运动强度具有较好的缓解大鼠OA进展的作用。而BOC-2可以抑制中等运动强度的治疗作用,证明了LXA₄在运动治疗OA中的重要作用。4.LXA₄通过抑制NF-κB信号通路缓解IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞内的炎症反应。5.不同时间的CTS（0.5Hz,10%）作用于IL-1β诱导的软骨细胞中,发现4h的CTS具有缓解炎症的效果。6.4h的CTS（0.5Hz,10%）通过引起AMP/ATP的升高以及Ca²⁺的内流激活AMPK,同时进一步抑制NF-κB p65的入核。7.适当的CTS对于正常的软骨细胞中collagenⅡ的含量无明显的改变,但可以降低其对IL-1β的反应程度。