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肝癌(Liver cancer)是世界范围内最常见和致死率最高的恶性肿瘤之一。我国是肝癌的高发区,因此深入研究肝癌的诊断与治疗具有重要意义。目前临床上治疗肝癌主要方法包括手术治疗及一些姑息疗法如化学药物疗法、肝动脉插管化疗、肝动脉结扎或栓塞、激光、放射及导向治疗等。但这些疗法各具优缺点和局限性,特别对于包括弥散性等特殊类肝癌的疗效不尽令人满意且副作用也较大。因此目前人们试图寻找包括免疫、分子生物及纳米技术等新型治疗方法和手段。1976年Morales A等[1]首次报道了卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)对浅表性膀胱癌的治疗效果并被普遍认可,从而使肿瘤免疫治疗成为新的研究热点。肿瘤免疫治疗的具体机制目前仍不完全清楚。张子臻等[2]使用不同浓度的结核分枝杆菌(Mycobecterium Tuberculosis,MTB)培养上清液作用于人肝癌细胞株HepG-2,发现一定浓度的MTB培养上清液能够抑制肝癌细胞的生长。然而MTB培养上清液中的成分较复杂,主要包含多种MTB分泌蛋白,如Ag85、ESAT6、Hsp16.3、CFP10等。MTB培养上清液中究竟是哪种成分发挥对肝癌细胞的抑制作用还需要进一步研究。本实验室曾经成功的构建多种结核分枝杆菌分泌蛋白和融合蛋白,如Hsp65[3]、Hsp16.3[4]、Ag85B-ESAT6[5]、HSP65-IL-2[6]、ESAT6-CFP10[7]等。Ag85B是MTB和BCG培养滤液蛋白中的重要保护性抗原之一,能够诱导机体产生强烈的Th1优势免疫应答[8];Hsp16.3是MTB在休眠期间表达量增加最多的蛋白,与MTB潜伏感染和休眠紧密相关[9]。因此我们在以往的研究基础上选用这两种蛋白进行融合表达,并检测纯化的融合蛋白对人肝癌细胞HepG-2的生长是否具有抑制作用,为肝癌的治疗研究奠定基础。目的运用基因工程和分子生物学技术,构建结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3,利用上述蛋白作用于HepG-2细胞,观察对肝癌细胞的生长抑制作用,并与实验室保存的Ag85B-ESAT6和Hsp16.3蛋白对HepG-2细胞的作用进行比较研究,探讨上述成分对HepG-2细胞生长是否有影响和作用,为肝癌的生物学治疗提供基础。实验方法和结果1融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的构建、表达和纯化以本实验室保存的质粒pProEX HTb-Hsp16.3[4]为模板,根据GenBank中公布的MTB hsp16.3基因序列设计引物,在hsp16.3基因上游引物中引入48bp的疏水柔性链接头,以保证两种蛋白在融合表达以后仍然具有原来各自的空间构象和折叠,通过PCR技术扩增hsp16.3基因,与pMD18-T克隆载体连接后测序,结果与GenBank中公布的hsp16.3基因序列一致。双酶切本实验室保存的重组质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6[5],切除其中的ESAT6,用Hsp16.3替换ESAT6,经过酶切鉴定后,阳性重组质粒命名为pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析证明成功表达了融合蛋白Ag85B-Hsp16.3,其分子量与预期一致。Western-blot鉴定证实该蛋白能够分别与抗Ag85B的多克隆抗体和抗Hsp16.3的单克隆抗体发生特异性反应,且能够与活动期结核病人的血清发生反应。可溶性分析显示该蛋白以不可溶状态存在,即包涵体。经Ni+-NTA亲和层析柱纯化获得融合蛋白,其纯度在90%以上。2 MTT法检测Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3对HepG-2细胞的作用将质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEX HTa-Ag85B-ESAT6和pProEX HTb-Hsp16.3转化大肠杆菌E.coli DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证明成功表达三种目的蛋白,各自的分子量与预期一致。然后采用Ni+-NTA亲和层析柱纯化后,再用透析的方法使蛋白复性,复性的蛋白经过滤后,以不同的浓度和作用时间分别与HepG-2细胞反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果显示,当蛋白浓度较低时(终浓度10μg/ml)三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显影响,当提高蛋白浓度时(终浓度20、40、80μg/ml)三种蛋白均能抑制HepG-2细胞的生长,并且呈剂量-时间依赖性,浓度越大、作用时间越长,其抑制作用越强;但是三种蛋白的抑制作用之间没有显著差别。结论1成功构建融合蛋白Ag85B-Hsp16.3,该蛋白能够分别与抗Ag85B的多抗和抗Hsp16.3的单抗以及活动期结核病人血清发生反应,在大肠杆菌中表达效率高。2成功的诱导表达并纯化Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种目的蛋白,复性后对HepG-2细胞的生长都具有抑制作用,呈剂量-时间依赖性,不同蛋白之间的抑制作用没有显著差异。