前言：　　胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，其发病率和病死率几乎持平，西方国家多发，在美国胰腺癌死亡率长期居于恶性肿瘤死因的第四位，在我国胰腺癌患者的数量也呈逐年递增趋势，据流行病学资料统计，目前我国的胰腺癌发病率已达5.1/10万，病死率居肿瘤死亡率的第六位。胰腺癌早期多无特异性症状，约80％的患者确诊时已经是肿瘤晚期，5年生存率小于5％，中位生存期仅为6个月。手术切除是目前治疗胰腺癌最有效的方法，但仅有约20％的患者符合手术指征，即使手术患者因为早期复发或远处转移术后的5年生存率也低于20％。大部分病人因为确诊时已经存在局部浸润或远处转移而预后更差。化疗药物的应用对于非手术患者的治疗提供了一线希望，但由于早期出现的高度耐药，治疗效果也不甚理想。因此，对于胰腺癌发病机制及生物学行为的研究具有重要的临床指导意义及实用价值。　　microRNA(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸(nt)的非编码小RNA，在基因转录后水平调控基因的表达。其作用机制是miRNA与其靶mRNA的3UTR区互补，当部分配对时阻抑靶mRNA的翻译，与靶基因3UTR区域完全配对时，使靶mRNA降解。经预测microRNA可能控制哺乳类动物30％的蛋白编码基因的活性，与其靶mRNA分子组成了一个复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生物学过程。有研究报道显示，miRNA在多种肿瘤中表达有改变，可能与肿瘤的发生、细胞凋亡和侵袭等有关，被认为可能起癌基因或抑癌基因的作用。　　随着miRNA在胰腺癌的研究越来越多也越来越深入。不仅通过microarry方法获得胰腺癌的miRNA表达谱，了解胰腺癌中所表达的miRNA，而且了解了许多胰腺癌中差异较大的miRNA的表达量的变化:miR-21、miR-18a、miR-196a、 miR-10b、 miR-16、miR-155、miR-181a、miR-181b、 miR-200b、miR-200c、miR-210上调;miR-34a、miR-101、let-7a、b、miR-217、miR-146、miR-148下调。已有文献报道认为这些在胰腺癌中表达有差异的microRNA(miRNA)在胰腺癌的生物学行为中起重要作用，例如:增殖、侵袭、转移、凋亡及药物抵抗等。microRNA(miRNA)在胰腺癌的功能研究涉及从生物学到疾病标志的研究。因此，miRNA可以用于胰腺癌的诊断、预后、药物及手术效果的评价。　　miRNA-99a是miRNA-99家族成员，位于染色体21q21，有研究表明miR-99a在诸多人类恶性肿瘤中呈现低表达状态，如肝癌、头颈鳞细胞癌、口腔鳞癌以及肾细胞癌、肺癌等。IGF-1R和mTOR是miR-99a的直接靶基因。提示miRNA-99a与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。同时，Turcatel等人的研究表明miRNA-99a参与了TGF-β诱导的乳腺细胞上皮间质转化，并可能与乳腺癌细胞的侵袭转移有关。此外，Jung等人报道称miRNA-99a在胰腺癌干细胞中表达下调，提示miRNA-99a可能与胰腺癌的发生发展以及其恶性表型有关。但有关miRNA-99a机制的研究还比较少，而且在胰腺癌组织中的研究尚未见报道。　　基于miR-99a的研究现状及其在肿瘤发生发展中的作用，本课题的研究目的是检测miR-99a在胰腺癌组织中的表达情况，然后通过改变miR-99a的表达水平观察其对胰腺癌细胞侵袭迁移和上皮间质转化的影响，并分析其可能作用的靶标在胰腺癌中的改变，进一步阐明miR-99a在胰腺癌发病机制中的作用，为深入理解胰腺癌发病的分子机制及分子靶向治疗奠定理论基础。　　方法与结果：　　1、在人胰腺癌组织标本中检测miR-99a表达情况，对比癌与癌旁组织间的表达差异，并分析miR-99a与临床病理特征间的相关性。　　本实验应用realtime PCR方法检测42例人胰腺癌组织及癌旁组织中miR-99a表达量，结果显示miR-99a在癌组织表达较癌旁组织下调。分析了胰腺癌组织中miR-99a表达水平与患者年龄、性别、分化程度、临床分期、淋巴结转移的关系。结果显示，胰腺癌组织中miR-99a的表达量与患者的临床分期和淋巴结转移具有相关性(P＜0.01)，而与患者的性别、年龄和肿瘤分化程度无关。miR-99a低表达组平均生存期为11个月，而miR-99a高表达组平均生存期为17个月，并经LogRank检验差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　2、在人胰腺癌组织标本中应用免疫组织化学方法检测mTOR、EMT关键分子E-cadherin的表达，并分析与miR-99a表达的相关性。　　应用免疫组织化学方法，评估42例人胰腺癌组织中mTOR、E-cadherin的表达水平。mTOR在正常胰腺组织中呈阴性，而在癌组织中57.14％(24/42)病例为高表达。经统计学分析胰腺癌组织mTOR表达水平与淋巴结转移呈正相关。E-cadherin在正常胰腺组织中均高表达，而在癌组织中38.09％病例低表达，经统计学分析证明胰腺癌E-cadherin表达水平与淋巴结转移呈负相关。并且在胰腺癌组织mTOR与E-cadherin具有相关性，呈负相关;miR-99a与mTOR具有相关性，呈负相关。　　3、miRNA-99a的阻断剂转染胰腺癌细胞，检测抑制miRNA-99a后对胰腺癌细胞的侵袭转移及上皮间质转化的影响，并进一步研究miRNA-99a影响上皮间质转化的靶基因。　　胰腺癌细胞系ASPC-1转染miR-99a阻断剂后， miR-99a表达进一步降低。MTT实验结果显示miR-99a表达降低促进ASPC-1增殖。细胞划痕实验及transwell实验结果显示miR-99a表达降低促进ASPC-1迁移、侵袭。Westernblot实验结果显示miR-99a表达降低促进mTOR及EMT相关蛋白N-cadherin，SMA，Vimentin的表达;抑制E-cadherin的表达。ASPC-1转染mTOR siRNA后， mTOR表达降低，同时E-cadherin表达增强;进一步转染miR-99a拮抗剂后可恢复mTOR的抑制，并降低E-cadherin的表达。　　结论：　　1、人胰腺癌组织中miR-99a表达低于癌旁组织， miR-99a低表达促进淋巴结转移并增加临床分期。人胰腺癌组织中miR-99a低表达提示预后不良。　　2、miR-99a低表达促进胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移。　　3、 miR-99a低表达下调EMT关键分子E-cadherin表达。　　4、miR-99a表达抑制可通过调节mtor蛋白而下调E-cadherin表达、促进胰腺癌细胞侵袭迁移。