前言近年来,随着外科学迅速的发展,全身麻醉的比例逐渐增高,它能够保证不同种类的手术能够得到无痛以及较为安全舒适的操作条件。虽然全身麻醉已经经历了接近两个世纪,但其具体作用机理仍然无明确的解释。随着外科手术量的增加,术后认知功能障碍等一些相关麻醉并发症逐年增加,有关麻醉药物对于中枢神经系统的作用成为大家关注的焦点问题,尤其是全身麻醉药物是否会影响婴幼儿、儿童将来学习以及记忆功能这一问题得到了全球麻醉及外科医生的普遍关注。七氟醚因其诱导及苏醒快,对肝肾功能以及血流动力学影响小等优点,目前在临床上应用较广泛。有研究认为,七氟醚可能引起中枢神经系统的炎症反应,还能引发氧化应激以及细胞内钙离子的稳态失衡,进而对大鼠的认知功能产生影响。动物实验研究表明,无论是静脉药物还是吸入药物都能引发中枢神经细胞的凋亡,尤其是在大脑组织发育的关键阶段,麻醉药物对中枢神经网络构建产生影响,使今后的学习以及记忆功能受到损害。动物研究发现,异氟醚除了能增加中枢神经细胞凋亡,还能够抑制祖细胞增殖,因而可降低新生动物今后的学习及记忆能力。有一项最近的研究发现,早期的麻醉能够增加儿童患学习障碍的风险。另外一项研究表明小于两岁的与大于两岁的儿童相比,麻醉后患有成年后行为异常的风险增加。这些研究暗示了麻醉神经毒性作用可能是儿童发展为学习障碍和成年后行为异常的危险因素。有临床前期实验阐述了七氟醚全麻对于发育中大脑的神经毒性作用与神经元凋亡和随之的认知功能障碍相关。因此,能够对抗神经元凋亡的治疗方法可能减轻七氟醚诱导的神经认知功能损害。在中枢神经系统中,鞘磷脂尤其是神经鞘磷脂是少突胶质细胞和髓鞘的基本组成成分。神经鞘磷脂可以被酶催化形成神经酰胺,后者可以被神经酰胺酶进一步催化形成鞘氨醇,鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶(sphingosine kinases, SphK)磷酸化而形成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)。SIP的信号传输路径能够刺激神经元的生长和存活。有报道称S1P能促进PC12细胞和人工培养的脑神经元存活。细胞内S1P水平增加可以抑制PC12细胞由于外源性神经氨酸的添加或者浆液缺乏导致的凋亡。而且,最近的一项研究表明,鞘氨酸激酶1/S1P信号传递的缺乏能够破坏神经元细胞的生长和存活,并破坏神经祖细胞在感觉神经节的发育过程。FTY720是一种较为新型的免疫抑制剂,它是从冬虫夏草的培养液中提取出具备免疫抑制作用的成分,再进行结构改造而成。它的免疫抑制作用不同于传统的淋巴细胞激活信号机制,而主要是通过对淋巴细胞定居和迁徙发挥作用。FTY720是磷酸鞘氨酸(S1P)受体激动剂,最近报道它能够提高大鼠或大鼠模型脑缺血、脑出血以及缺血性卒中、急性脊髓损伤的神经产物,进而显著促进神经功能的恢复。我们本研究的目的是FTY720所产生的神经保护效应是否能够对抗七氟醚引发的神经毒性。研究方法1.动物实验所有的实验程序都获得山东省立医院动物常务委员会批准,120只7天龄SD大鼠从中国医学科学研究院获得,动物可以自由饮水进食,并提供12小时昼夜循环。2.初级海马神经元的准备海马神经元是由18天大鼠制取,海马组织从头部解剖,神经元通过胰蛋白酶和研磨来分离。神经元被保存在37。C含5%CO2和95%空气潮湿环境的无血浆B27母细胞介质中。神经元是经体外实验培养7天采用抗-MAP抗体提纯。3.麻醉暴露神经元在4×105/ml密度的六孔盘中培养。大鼠幼崽在一个37。C的密闭空间内接触七氟醚,七氟醚由一个固定口径的喷雾器向空间内传送。接触气体包括七氟醚混合了3%的C02、21%的02和平衡N2。活体实验是采用出生后7天的大鼠幼崽。随机分成5组(n=24每组)。对照组暴露在5%C0221%02和平衡N2混合气体中6小时.其他四组的所有大鼠注射溶剂(DMSO)、FTY720 (1mg/Kg), FTY720和MEK抑制剂(U0126 10mg/Kg),或者FTY720和VPC20319 (0.5mg/Kg)。均暴露于2.1%的七氟醚5%C0221%02和平衡N2混合气体中6小时。我们选择2.1%的七氟醚浓度是与临床相关的大鼠不能致死的浓度。气体以2L/min速度吹入大鼠的环境中。七氟醚暴露后,每组中12只大鼠立即被实施安乐死,采集海马组织做免疫印迹分析。其他大鼠继续生长至35天用作神经认知评估。4.免疫印迹分析正如前面描述的海马组织和神经元培养为免疫印迹做准备。神经元培养和海马组织的溶解产物以12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺琼脂电泳分离,然后进行PVDF转膜。初级抗体为抗ERKl/2抗体以及抗Bax抗体和抗Bcl-2抗体,随后用辣根过氧化酶标记的二级抗体孵育并显色分析。5.细胞凋亡分析细胞凋亡的检测采用FITC标记的膜联蛋白V(Annexin V)凋亡试剂盒进行。细胞用冰的磷酸盐缓冲剂洗脱,然后以1×106cell/ml的浓度以缓冲液混悬。细胞采用膜联蛋白v-FITC和Propidium iodide在黑暗环境中染色15分钟后以流式细胞仪分析。Annexin V-FITC阳性且Propidium iodide阴性的细胞被认为是凋亡细胞。6.神经损伤的评估旷场试验是用来评估一般运动活动、探索习惯和前面提到的焦虑。大鼠幼崽被暴露于七氟醚中,然后置于旷场中,观察大鼠在一定时间内所通过区域数值。物体识别实验是用两组新事物识别任务来评估,大鼠幼崽在接触七氟醚之前,先在盒子中用两个识别物体来预检测建立基线。七氟醚暴露后,将大鼠幼崽放在盒子里,允许它们探索两个放置在一定距离的识别物体三分钟。它们被移入盒子两小时后将其中一个熟悉的物体换成不同形状和外观再重新测试。探索所有物体的时间被记录。数据用大鼠幼崽探索新物体与熟悉物体时间百分比来表示。研究结果].七氟醚是以一种时间依赖性方式诱发神经元凋亡。神经元凋亡在七氟醚暴露3,6,9小时后采用流式细胞仪评估。与对照组相比神经元凋亡随时间增长。神经元凋亡数分别是11.4±0.5%,24.9±1.9%,28.2±2.3%。相反,对照组暴露于混合气体组9小时后凋亡率无明显变化。2.FTY720减轻体外实验七氟醚诱发的神经元凋亡。为了阐述FTY720对于七氟醚诱发神经元凋亡的保护效应,细胞在暴露七氟醚时用不同浓度的FTY720培养。之前的研究表明超生理微摩尔浓度的FTY720致大鼠小脑神经元凋亡。此外,一项早期临床前期动物模型研究报道0.14μM浓度的FTY720才具有治疗作用。因此,在我们的实验中,我们检测5-10nM的FTY720对神经元的凋亡效应。结果表明,10nM浓度的FTY720能有效保护神经元对抗七氟醚的促凋亡作用。(17.2±1.3%,P<0.05,七氟醚暴露6小时)。应用FTY720 50和100nM浓度,凋亡细胞降低到8.9±1.1%和6.1±0.7%。3.FTY720激活的S1P受体能够预防体外实验七氟醚诱导的神经细胞凋亡当FTY720被2型SPHK转化成磷酸盐时,在毫微摩尔浓度下,便具备了S1P1、S1P3、S1P4、S1P5的全激动剂功能。为了验证这一假设FTY720主要担当神经元中S1P1激动剂的这一假设,我们检测了选择性S1P1激动剂SEW2871和S1P1拮抗剂VPC23019对于七氟醚诱导的神经细胞凋亡作用,0.5μM的SEW2871与50nnM的FTY720具有相似的神经保护作用。反之,0.5μM的VPC23019能够消除FTY720的神经保护作用。总之,这些结果表明FTY720对于S1Pl的激活能够阻碍七氟醚诱发的神经凋亡。4.FTY720通过使ERKl/2磷酸化来防止神经元凋亡新的证据表明通过S1P1受体的存活信号与ERK1相关。因此,我们测试FTY720是否能够通过激活ERK1/2发挥抗凋亡作用。当培养的神经元暴露于七氟醚中时,暴露组与对照组相比磷酸化的ERK1/2显著降低,然而,FTY720组的磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)水平能够显著维持。此外,VPC23019处理能够消除暴露于七氟醚下的FTY720对于p-ERK1/2水平的维持作用,表明FTY720通过结合S1P1受体来激活ERK1/2信号传导。为了进一步明确ERK1/2在FTY720神经保护中的作用,在神经元暴露于七氟醚时用FTY720和MEK抑制剂(U0126,5μM)处理,FTY720的抗凋亡作用被U0126消除,这些数据表明,FTY720通过S1P1依赖的ERK1/2路径激活来保护神经元对抗七氟醚诱导的凋亡。5.FTY720通过调节Bcl2/Bax比例来减弱七氟醚诱导的神经毒性。麻醉剂诱导的神经元凋亡对麻醉剂神经毒性其重要作用。为了检验Bcl-2/Bax比例的调节是否是FTY720对抗七氟醚诱发神经凋亡的基础,我们检测Bcl-2,Bax细胞凋亡蛋白的水平。我们的结果表明七氟醚暴露能明显降低Bcl-2/Bax比例,导致断裂细胞凋亡蛋白酶-3水平升高。相反,FTY720升高和Bel-2/Bax比例的降低,能够使七氟醚处理过的神经元中的断裂细胞凋亡蛋白酶-3减少。此外,我们发现,加入VPC23019或U0125能够逆转FTY720对于暴露七氟醚的神经元的调节效应。总而言之,FTY720通过调节Bcl-2/Bax比例来防止七氟醚诱发的神经凋亡。Bcl-2/Bax比例调节是通过S1P1依赖的ERKl/2激活来完成。6.FTY720能够减轻七氟醚暴露引起的神经损伤FTY720的神经保护作用采用大鼠幼崽做测试,有报道称给予大鼠0.1 ～1mg/kg的FTY720时,血浆浓度低于1ng/ml,给予1mg/kg是安全的。因此,大鼠幼患在暴露七氟醚之前注射媒介物(DMSO)或1mg/kgFTY720, FTY720和MEK抑制剂(U0126,1mg/kg)或FTY720和VPC23019 (0.5mg/kg)。尽管七氟醚加媒介组大鼠活动距离轻微降低,但与其他组比无显著差异,表明大鼠没有情绪抑制及运动功能障碍,反之,应用两个物体间的识别任务实验来测试学习和识别记忆。七氟醚加媒介组的大鼠幼崽在探索新物体时花费了更多的时间,然而七氟醚加FTY720组与对照组花费时间相似,表明FTY720可以降低七氟醚诱发的神经认知损伤。我们同时观察到共同应用U0126和VPC23019能够消除FTY720对于七氟醚诱发的神经毒性的神经保护作用。7.FTY720通过抑制七氟醚诱发的神经元凋亡来提高神经产物。为了进一步明确FTY720通过防止神经元凋亡来保护大鼠幼崽对抗七氟醚诱发的神经毒性,我们采用免疫印迹分析法检测凋亡分子与体外试验相似,注射了FTY720的大鼠神经元凋亡数少于只注射媒介组。由断裂细胞凋亡蛋白酶-3水平的降低可以证明,此外,向大鼠体内注射FTY720的同时注射U0126或VPC23019,断裂细胞凋亡蛋白酶-3水平升高,出现了与活体实验一致的神经保护作用。在活体内FTY720对于Bcl-2, Bax和ERK1/2的调节效应也被检测到,表明了在活体内FTY720通过SlP1依赖的ERK1/2信号传导路激活来调节Bcl-2/Bax比例。研究结论通过我们的研究,可以与既往的研究相互印证,证实七氟醚可以诱导神经元凋亡,并可以导致大鼠神经系统的损伤,导致认知与学习能力的降低,但是对于深层次的情绪方面如焦虑并没有明显影响。FTY720对七氟醚导致的神经元凋亡以及大鼠神经系统出现的损伤具有保护作用,可以消除七氟醚所诱导的凋亡以及减轻七氟醚导致的大鼠认知能力降低。通过对S1P传导通路进一步细化的研究表明,FTY720的这种保护作用是通过作为S1P受体激动剂而作用于S1P信号传导通路来起作用,具体作用位点应当作用于ERK1/2磷酸化和调节Bcl-2/Bax比例来防止神经元凋亡、减轻神经系统毒性。