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褐飞虱Nilaparvata lugens St?l是一种严重威胁水稻产量的害虫。种植抗性水稻是防治褐飞虱的重要手段,但随着抗性水稻持续广泛的种植,褐飞虱对抗性水稻的适应能力也随之增强,使得原有的一些抗性水稻品种抗性失效。研究褐飞虱致害性变异机制对抗性水稻的培育及褐飞虱的防治均具有非常重要的意义。Insulin/PI3K/Akt信号通路在生物体的生长发育、个体大小以及耐受性等方面起着非常重要的调控作用,该通路受到抑制时生物体的生长发育会延迟,体型会变小,同时耐受性会增加。这些现象与褐飞虱在适应抗性水稻过程中的表现非常相似。因此,研究Insulin/PI3K/Akt信号通路在褐飞虱中的功能,有利于揭示褐飞虱致害性变异机制。本研究根据褐飞虱转录组提供的核心序列信息,用c DNA末端快速克隆技术(RACE)克隆得到了该通路相关的3个基因的全长c DNA,分别为蛋白激酶B互作蛋白基因(Nl AKTIP),磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基基因(Nl PIK3R1)和核糖体蛋白S6激酶基因(Nl RPS6KA2)。应用荧光定量PCR技术对3个基因在不同发育时期以及褐飞虱从感性水稻品种TN1转到抗性水稻品种RHT过程中的表达规律进行了测定,并利用RNAi技术研究了Nl AKTIP和Nl PIK3R1 2个基因在褐飞虱体内的生理功能。研究结果如下:一、褐飞虱蛋白激酶B互作蛋白基因Nl AKTIP的克隆、表达和功能研究根据褐飞虱转录组提供的蛋白激酶B互作蛋白基因核心序列信息,应用RACE技术克隆得到了Nl AKTIP基因全长c DNA,全长为964 bp。荧光定量PCR结果表明,Nl AKTIP基因在褐飞虱各个龄期以及不同性别成虫中均有表达,且在怀卵褐飞虱中表达量最高,说明该基因对羽化后雌性褐飞虱卵巢及卵的发育至关重要。同时发现Nl AKTIP基因表达量在褐飞虱适应抗性水稻品种RHT的过程中(RF1-RF5种群)呈现下调的趋势,而在适应抗性水稻品种RHT后的Rh种群会有所上调。RNAi结果表明,随着干扰浓度的递增,褐飞虱的体重也随之减轻、体型也越小。低浓度干扰组平均体重为1.36 mg,中浓度和高浓度干扰组分别为1.34 mg和0.77 mg,与空白对照组(2.21 mg)和ds GFP对照组(1.74 mg)的体重相比存在显著差异(P<0.05)。该基因的干扰后还会导致褐飞虱羽化和卵巢发育的推迟。如,高浓度干扰组可以推迟褐飞虱羽化7天以上,当该实验组褐飞虱的卵巢发育到II级阶段时,空白对照和ds GFP对照组的卵巢已发育到IV级。以上研究结果显示,Nl AKTIP与褐飞虱的生长发育和体型大小有着密切联系。二、褐飞虱磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基基因Nl PIK3R1的克隆、表达分析和功能研究根据褐飞虱转录组提供的PI3K p85α亚基基因核心序列信息,应用RACE技术获得了编码PI3K p85α亚基基因Nl PIK3R1,c DNA序列全长为2694 bp。荧光定量PCR测定结果表明,Nl PIK3R1基因在褐飞虱若虫和雄虫中表达量均较低,但在怀卵雌虫中大量表达。另外,Nl PIK3R1基因表达量在褐飞虱适应抗性水稻品种RHT的过程中呈现下调的趋势,说明该基因参与了褐飞虱致害性变异的过程。通过喂食ds Nl PIK3R1对Nl PIK3R1基因进行RNA干扰,导致靶标基因的表达明显受到抑制,高浓度组的抑制效果尤为明显。喂食ds Nl PIK3R1对褐飞虱具有极显著致死效果,高浓度组的褐飞虱在饲喂第7 d时,存活率仅为37.5%,相比于空白对照组87.00%和ds GFP对照组76.67%,均达到了极显著差异(P<0.01)。对Nl PIK3R1基因干扰还可导致褐飞虱羽化速率变慢和体重变轻。本研究结果显示,Nl PIK3R1基因对褐飞虱的生存、生长和发育具有重要作用,干扰结果与褐飞虱在适应抗性水稻上的表现相符,表明该基因在褐飞虱致害性变异的过程中可能起着非常重要的作用。三、褐飞虱核糖体蛋白S6激酶基因Nl RPS6KA2的克隆与表达分析根据褐飞虱转录组提供的核糖体蛋白S6激酶基因核心序列信息,应用RACE技术获得了编码核糖体蛋白S6激酶基因Nl RPS6KA2,c DNA全长为2491 bp。通过荧光定量PCR对该基因进行时序表达检测,发现Nl RPS6KA2在不同龄期和不同性别的褐飞虱中均有表达,且表达量较低,在怀卵雌虫中则大量表达,说明该基因也与褐飞虱的卵巢及卵发育相关。同时发现Nl RPS6KA2基因表达规律在褐飞虱适应抗性水稻品种RHT的过程中与Nl AKTIP和Nl PIK3R1相似,都呈现先下调后上调的趋势,说明Nl RPS6KA2基因也参与了褐飞虱致害性变异过程。综上,本研究结果为进一步研究Insulin/PI3K/Akt信号通路在褐飞虱中的功能奠定了基础,为阐明褐飞虱适应抗性水稻的机制提供了新思路。