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普鲁兰酶能特异性水解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,在淀粉水解工艺过程中有着很高的应用价值。来源于Bacillus naganoensis(ATCC53909)的普鲁兰酶PulB性质优良,但其在60℃的热稳定性很差,且表达量低,仍难应用于工业化生产中。为了获得表达水平高,热稳定性强的普鲁兰酶,本文先后对普鲁兰酶PulB进行了翻译速率优化和热稳定性改良研究。 为了提高PulB表达水平,本文从极端稀有密码子、类SD序列、mRNA二级结构三个方面对目标基因自身进行了优化。通过改善序列中精氨酸的密码子使用,获得了普鲁兰酶表达量分别提高34.37%的PulB-573R突变体和提高16.89%的PulB-645R突变体,组合突变后的PulB-R573/R645突变体表达量较野生型提高了47.73%。此外,我们将PulB序列中的类SD序列进行了敲除突变,获得了表达量提高34.6%的SD2突变体。在提高普鲁兰酶PulB的热稳定性的研究中发现,耐热突变体PulB-N387D中第387位的天冬氨酸在使用GAC密码子时表达量大幅下降,而用同义密码子GAU替换后,消除了mRNA二级结构中的茎环结构,使PulB-N387D2的表达水平较PulB-N387D1提高了93%。 由于野生型普鲁兰酶PulB的热稳定性较差(65℃下t1/2仅有3.5 min),实验室前期通过同源建模、序列比对,构建了PulB一系列单点突变体,筛选出多个普鲁兰酶耐热突变体。本研究在改善耐热突变体PulB-N387D表达水平的基础上,组合3个有益单点突变体(D328H、N387D、A414P),构建PulB-D328H/N387D和PulB-D328H/N387D/A414P突变体,其中PulB-328/387/414耐热性最好,它在65℃下的t1/2比PulB-WT提高12.9倍,Tm值比野生型提高了4.91℃,并且酶促动力学实验表明PulB-328/387/414的kcat和kcat/Km比PulB-WT分别提高了38.8%和12.9%。热稳定性最好的组合突变体PulB-D328H/N387D2/A414P在以地衣芽孢杆菌为表达宿主的发酵液上清中的普鲁兰酶活性达到45 U/mL,较大肠杆菌表达系统表达量提高了18.5倍。