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心脏自主神经系统(autonomic nervous system, ANS)包括心脏外在ANS和内在ANS。心脏内在ANS主要包括位于心外膜脂肪垫处的神经丛(ganglionated plexi, GP)、连接GP的神经纤维、Marshall韧带富含的神经节及心肌神经末梢构成。GP受肾上腺素能神经和迷走神经末梢支配,GP内的神经元发出节后纤维支配心脏,其中位于窦房结尾端靠近右上肺静脉与右心房交界处脂肪垫内前右GP (anterior right ganglionated plexi, ARGP)和位于下腔静脉与左、右心房交界处脂肪垫内下右GP (inferior right ganglionated plexi, IRGP)分别支配窦房结(sinoatrial node, SAN)和房室结(atrioventricular node, AVN)及其附近的心房肌。GP消融可以影响心脏ANS功能,预防和抑制房颤的发作,但GP消融导致的去神经效应会不同程度地破坏心脏内在ANS,这可能影响SAN与AVN的功能与结构。因此,GP消融的安全性问题,尤其是对SAN的变时功能与AVN的变传导功能的影响应该受到重视。目前,GP消融对SAN和AVN电生理功能的急性期影响尚无定论,且缺乏关于GP消融对SAN和AVN功能与结构远期影响的依据,据此,本研究采用解剖定位结合高频刺激的方法定位犬的ARGP和IRGP,并进行射频消融,观察消融后即刻与1、6、12个月后的SAN和AVN电生理功能的变化,并观察ARGP所支配的SAN与IRGP所支配的AVN细胞形态结构,以及SAN和ANV组织连接蛋白(Connexin, Cx)43和45表达的长期动态变化,目的在于探讨ARGP和IRGP消融的近期和远期安全性,为保证GP消融的临床安全应用提供理论依据。本研究的主要内容包括两个部分：第一部分心房神经节丛消融对犬窦房结与房室结电生理功能的远期影响研究目的GP消融是房颤的重要治疗方法,目前GP消融对SAN与AVN电生理功能的急性期影响尚不明确,更是缺乏长期、动态的观察。本研究旨在观察消融正常犬模型的心房ARGP和IRGP对SAN与AVN的电生理功能影响,探讨GP消融的安全性,为GP消融的临床应用提供理论依据。研究方法取24条杂种犬为研究对象,应用3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉。行气管切开并插管,给予呼吸机辅助呼吸。记录肢体导联心电图,并分别经颈内静脉和股静脉放置心内电极导管2根至高位右房和希氏束,记录右房和希氏束电图。应用多功能电生理刺激和记录仪测定SAN及AVN功能。1.SAN功能包括静息心率、不同周长起搏(330ms、300ms、280ms、250ms)时SAN恢复时间(SNRT)及校正的SNRT (cSNRT),起搏脉宽2ms,强度为10倍起搏阈值,每次起搏持续2 min,暂停2 min后进行下一次起搏。SNRT测定：应用多功能电生理仪对高位右房进行快速起搏,引起SAN的抑制,当停止起搏时,最后一个起搏波至第一个恢复的窦性心房波之间的时间为SNRT; cSNRT:SNRT减去起搏前正常的窦性间期。2.AVN功能包括不同周长起搏(330ms、300ms、280ms、250ms)的AH间期、诱发心房颤动时的平均心室率(应用多功能电生理刺激仪进行右房短阵超速起搏诱发房颤[S1S1=100 ms],平均心室率为房颤时10个心室搏动的平均周长)、AVN前传不应期(采用S1S2程序刺激,S1：S2=8：1,递减步长10ms)及递增起搏时出现文氏和2：1房室传导阻滞(AVB)时的起搏周长。SAN和AVN电生理功能检测完毕后,实验犬左侧卧位,经右侧第四肋间开胸,暴露心脏,辨认右心房、上下腔静脉、右肺静脉等重要的解剖位置。ARGP和IRGP定位：(1)解剖定位：ARGP位于窦房结尾端靠近右上肺静脉与右心房交界处；IRGP位于下腔静脉与左、右心房交界处。(2)高频刺激定位：应用电生理刺激仪对ARGP和IRGP的解剖位置处脂肪垫给予高频电刺激(20 Hz,0.1 ms,0.6-4.5V)时,出现迷走反应即心率明显减慢或出现房室传导明显延长即为GP所在部位。定位后,对24条犬的ARGP和IRGP进行射频消融,消融成功后,即刻再次测定SAN和AVN的上述电生理指标。24条犬分随机3个组,分别于消融1、6和12个月后,重复检测以上电生理指标。数据分析：统计分析3组犬SAN和AVN的电生理指标在GP消融前后的变化。急性期变化采用配对t检验对比所有实验犬消融前后的变化；远期变化采用单因素方差分析对3个组进行组内比较。结果最终22条犬完成研究：1月组8条,6月组8条,12月组6条。1.SAN电生理功能的变化：在消融后即刻(n=22),静息心率增快(164±10vs 170±9 bpm,P=0.029),各起搏周长下的SNRT、cSNRT缩短。消融1个月后,静息心率和SNRT、cSNRT恢复正常。至消融6个月和12个月时,SAN的电生理指标与消融前相比均无统计学差异。2.AVN电生理功能的变化：消融后即刻,AVN有效不应期延长(108±10 vs 125±13 ms,P=O.000),文氏AVB起搏周长(175±10 vs 189±16 ms,P=0.001)和2：1 AVB起搏周长(157±12 vs 171±15 ms,P=0.004)均延长,房颤时心室率(279±28 vs 265±30 bpm,P=0.11)和各起搏周长下的AH间期无显著变化；消融1个月后,AVN有效不应期恢复正常,而房颤时心室率(242±27 bpm)降低(P=0.044)、短起搏周长(280ms:87±11 vs 104±12ms,P=0.029；250ms:94±12 vs110±12ms,P=0.035)下AH间期延长,文氏(180±11 vs 200±13 ms,P=0.01)和2：1(159±14 vs 180±13 ms,P=0.015)传导阻滞的起搏周长仍延长；至消融后6个月,AVN功能恢复至消融前水平。结论ARGP和IRGP消融后,SAN功能在短时间内增强,表现为静息心率增快,SNRT和cSNRT缩短,消融后1个月,SAN功能恢复至消融前水平：消融后1个月时,AVN传导功能下降,GP消融6个月后,AVN功能恢复至消融前水平。ARGP和IRGP消融后消融可导致SAN和AVN电生理功能短时间的变化,但无长期影响,提示ARGP和IRGP消融具有良好的安全性。第二部分心房神经节丛消融对犬窦房结与房室结结构远期影响研究目的目前针对GP消融导致的SAN、AVN和心肌组织去神经支配后,其形态结构及蛋白表达的变化尚不明确,尤其是远期的变化。本研究旨在观察消融正常犬模型的心房ARGP和IRGP对SAN与AVN组织结构及连接蛋白表达的远期变化,探讨GP消融后连接蛋白表达与电生理功能变化之间的关系,从连接蛋白的角度揭示电生理功能变化的原因,并为GP消融的临床安全应用提供理论依据。研究方法在消融组(实验组)24条犬之外,另取8条犬作为假手术组(对照组)。为消除电生理检查过程带来的影响,假手术组的SAN和AVN功能也要检测,然后行开胸手术,但不行射频消融。对于消融组的3个亚组,在相应的时间点(消融后1个月、6个月、12个月)行电生理指标再次检测完毕后,立即开胸、取出心脏(假手术组的8条犬行电生理检查之后直接开胸、取出心脏),剪取SAN和AVN组织标本,行组织病理切片、HE染色,光镜下观察SAN和AVN形态结构变化。因SAN和AVN与其周围组织紧密结合或混杂(只在显微镜下才可辨认其大体边界),故无法应用Western-blo进行蛋白定量分析,本研究应用免疫组织荧光方法检测SAN和AVN连接蛋白43(Cx43)和45(Cx45)的表达,应用图像分析仪分析Cx43和Cx45的平均光密度(mean optical density, MOD)代表其表达水平。数据分析：采用单因素方差分析对比假手术组与GP消融组消融后各时间点SAN和AVN Cx43和Cx45表达的差异。结果1.SAN和AVN形态学结构变化(1)SAN：SAN结构致密,中央区细胞聚集成团或呈束状。4组SAN标本均可见窦房结动脉。SAN内可见脂肪组织侵入。与消融前相比,消融后1、6、12个月的SAN细胞数及排列方式均无明显变化。(2)AVN位于房间隔和室间隔之间,与中心纤维体相邻,4组标本的AVN与中心纤维体之间可见大量脂肪组织(冰冻切片过程中形成空洞)。消融前和消融后1、6、12个月的AVN形态结构无显著差异。2.SAN和AVN组织Cx43、Cx45表达的变化(1)SAN：消融后1个月时,消融组SAN的Cx43(0.14±0.04 vs 0.52±0.04,P=0.000)和Cx45(1.28±0.29 vs 3.17±0.40,P=0.000)表达水平显著低于假手术组；与假手术组相比,消融后6个月(Cx43：0.51±0.03,P=0.865；Cx45：2.87±1.42,P=0.179)和12个月(Cx43：0.48±0.03,P=0.268；Cx45：3.08±0.20,P=0.933)时SAN组织Cx43和Cx45的表达水平无显著变化。(2)AVN：消融组AVN的Cx43(0.35±0.07 vs 1.09±0.17,P=0.000)和Cx45(2.11±0.42 vs 4.32±0.40,P=0.000)表达水平显著低于假手术组；与假手术组相比,消融后6个月(Cx43：0.94±0.33,P=0.787；Cx45：4.43±0.62,P=0.969)和12个月(Cx43：1.16±0.13,P=0.939；Cx45：4.29±0.45,P=0.999)时AVN组织Cx43和Cx45的表达水平无显著变化。结论ARGP和IRGP消融后消融后1个月,SAN和AVN组织的Cx43和Cx45表达水平下降,至消融后6个月时恢复正常。GP消融后的房室传导功能障碍可能与会ANVCx43和Cx45的表达下降相关。ARGP和IRGP消融对SAN和AVN的结构没有远期的影响。