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热激蛋白(Hsp)是一类在热激条件下大量合成的蛋白质,并与植物体高温、低温、干旱等逆境应答以及植物的生长发育密切相关。其中,Hsp90家族蛋白是一类分子量为80～90kD的Hsp蛋白质。它们具有帮助蛋白质折叠,保持蛋白质结构完整等功能。Hsp90在进化上十分保守,真核生物中Hsp90同源性相差最远的也超过50%的同源性。Hsp90划分成3个区域:N端的ATP结合/水解区域,具有不同电荷的中间区域,以及能提供2聚化作用结合部位并含MEEVD保守末尾的C端区域。Hsp90的三个区域都能识别并结合不同蛋白质。近年来关于Hsp90的研究主要集中在哺乳动物中,并发现了越来越多的Hsp90结合蛋白。但对于植物Hsp90的研究相对较少。为了解植物Hsp90家族的在逆境反应过程中的作用,本文克隆了OsHsp82基因,在调查其逆境条件下的表达情况的基础上,克隆了OsHsp82的结合蛋白,以便更进一步分析其生理功能。主要结果如下:1.采用荧光差显(Fluorescent Differential Display,FDD)技术,比较分析了低温和干旱处理与未处理的水稻叶片及根中的mRNA表达,并利用H.A.Yellow-PAGE(含0.1%H.A.Yellow)再分离与大矩阵(macroarray)筛选相结合的方法,发现了一个与OsHsp82cDNA高度同源(＞95%)的差异片段,通过数据库比对分析克隆OsHsp82全长cDNA序列。通过氨基酸同源性比较,发现OsHsp82与玉米Hsp82(84.9%)、拟南芥Hsp90-2(90.7%)、大麦Hsp90(94.7%)同源性较高,且都在C端具有MEEVD片段。2.运用RT-PCR技术分析了OsHsp82在高温和低温处理条件下的表达情况,发现OsHsp82在这两种逆境胁迫下均能被诱导,但在高温条件下OsHsp82的诱导更为迅速和强烈。说明OsHsp82与水稻在高温和低温胁迫下的应答有密切关系。3.运用酵母双杂交技术,以OsHsp82为诱饵蛋白,从水稻低温和干旱cDNA文库中筛选出了7个结合蛋白基因,这7个基因编码的蛋白分别是:水稻PRP1蛋白、水稻RBBI3-3蛋白、水稻光和系统Ⅱ10kD多肽、水稻CYP98蛋白和三个未知功能蛋白。并讨论了其中4个结合蛋白的功能,可能的结合模式以及可能参与的调节功能。4.构建了pGEx-Hsp82载体,并在体外表达、纯化了OsHsp82蛋白。同时构建了pET-RBBI3-3载体,得到了在体外表达的RBBI3-3蛋白。通过GST-pulldown系统做体外结合实验,但并未在体外检测到它们的结合,并对结果进行了分析。