包虫病(Echinococcosis)是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)及多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的幼虫寄生于人及某些动物等宿主体内所致的一种严重的人畜共患性疾病,我国西北广大农牧区是包虫病的主要流行区,在新疆以细粒棘球绦虫所致的囊型包虫病(Cystic Echinococcosis,CE)尤为多见,临床治愈包虫病较为困难,包虫病已成为影响我国西部地区农牧民身体健康和制约牧区经济发展的一个重要原因之一。因此,CE的免疫预防成为当前研究的热点,但在不同的地理环境和宿主中,细粒棘球绦虫存在着实质性的基因遗传差异,株间发育(如虫卵发生)差异将影响对治疗药物的敏感性,抗原变异也可影响对人体包虫病的准确监测以及免疫预防,因此对新疆细粒棘球绦虫基因多态性研究、分子生物学及血清学实验诊断方法研究与包虫病的流行防治直接相关。第一部分新疆细粒棘球绦虫基因多态性研究为了探讨新疆不同地区不同宿主来源的细粒棘球绦虫株系间基因序列差异,确定其基因型别和地理分布,不同分类水平上的细粒棘球绦虫类群之间的系统发育、进化机制和种群遗传变异及分化,指导临床治疗与预防包虫病。本研究采用DNA测序法对细粒棘球绦虫mtDNA CO1和mtDNA Cyt b基因片段进行序列分析,明确检测到的细粒棘球绦虫的基因型及其株内遗传变异,构建系统发育进化树。测定的新疆细粒棘球绦虫CO1、Cyt b基因片段长度分别为789bp和498bp。通过对新疆98个细粒棘球绦虫分离株标本(57例CE病人、11只感染羊、4只感染狗)CO1基因序列分析,发现新疆地区存在细粒棘球绦虫G1、G3、G6三种基因型、23个基因单倍体,首次发现G3基因型感染人群,这可能是新疆细粒棘球绦虫G3基因型发生了某些遗传变异,对人体具有感染性,并在1个病人分离株中发现G6基因型,证明G6基因型对人体具有致病性。新疆主要流行株为G1型(97%),各地区G1型分离株序列同源性为99.2%～100%,存在20个不同的基因单倍体,共检测到25个核苷酸变异位点,约占分析位点总数的3.2%,涉及15个氨基酸变化,碱基的变化为转换和颠换,且转换明显多于颠换,碱基替换大都发生在密码子的第3位点,占变异总数的48%,其次为第1位点,占28%,第2位点最保守,仅占24%,转换和颠换的比值在第1位点、第2位点分别为2.5(5/2)、5(5/1),第3位点均为转换。在对CE病人分离株、羊源分离株和犬分离株基因序列分析中发现不同宿主分离株之间序列没有明显差异,但同一宿主不同感染部位分离株基因序列不同,存在不同的G1型基因单倍体。将所检测到23个新疆细粒棘球绦虫基因单倍体序列与Genbank中已登录细粒棘球绦虫基因序列进行同源性比较分析,9个新疆细粒棘球绦虫G1型基因单倍体序列变异在Genbank中有100%同源序列,但11个G1型基因单倍体、2个G3型基因单倍体、1个G6型基因单倍体序列未找到相同变异序列,是新发现的细粒棘球绦虫基因序列。Cyt b基因适合用于区分种间及种下分类分析,对细粒棘球绦虫种系发育研究起到补充作用。Cyt b基因序列分析发现新疆细粒棘球绦虫G1、G3、G6基因型序列有差异,差异为10.7%,根据Cyt b基因序列绘制的分子系统发生树与CO1基因序列构建分子系统发生树结果相符,进一步证实结果的可靠性。第二部分微卫星DNA标记技术鉴定细粒棘球绦虫基因型探讨本研究以细粒棘球绦虫的Sca、Emsk、C106微卫星序列为分型标记,利用荧光PCR-基因扫描技术鉴定新疆不同地区CE病人细粒棘球绦虫分离株的基因型和杂合度,多个微卫星标志联合分析可提高基因分型的鉴别力,纯合子的PCR产物由相同碱基序列的DNA片段组成,而杂合子的PCR产物则包括两种不同长度的DNA片段,长度差异由核心序列的不同串联重复数引起,通过精确测定PCR产物长度就能确定微卫星基因型。我们采用FAM和HEX两种不同颜色的荧光染料分别标记三对微卫星序列引物,PCR扩增后,利用ABI Prism 310型全自动DNA分析仪对扩增产物进行毛细管电泳,用Genescan 2.1软件计算产物的碱基个数。不同微卫星标志的PCR产物可在同一加样孔中上样、电泳,不同片段大小和颜色的扩增峰代表不同基因位点扩增产物,单个扩增峰为纯合子,双扩增峰为杂合子,同时精确测定3个基因位点的基因型。本实验结果表明44例CE病人的66个分离株标本均为细粒棘球绦虫纯合体,其中43例病人的65个细粒棘球绦虫分离株标本经PCR及微卫星标记鉴定为G1基因型;1例病人的1个细粒棘球绦虫分离株标本经PCR及微卫星标记鉴定为G6基因型。微卫星标记鉴定结果与DNA序列分析基因型结果一致。在我们的研究中发现家犬的肠内存在细粒棘球绦虫G1型(羊株)和G6型(骆驼株)的混合基因型感染和杂和现象(数据未报道),但在本研究病人标本中未发现细粒棘球绦虫的杂和现象,可能是细粒棘球绦虫大多为自体受精,发生杂和现象的机会较少。微卫星DNA标记能够从基因水平快速、精确地鉴定细粒棘球绦虫分离株的基因型和杂和度,对细粒棘球绦虫的流行病学和致病性研究有重要价值。第三部分PCR-RFLP技术用于细粒棘球绦虫种株鉴定的研究为了对细粒棘球绦虫种株进行鉴定以及明确基因型的地理分布,本研究应用PCR-RFLP方法,对新疆不同地区CE病人分离株标本提取DNA,用特异性mtDNArrnL引物进行PCR扩增,PCR扩增产物再用限制性内切酶SspⅠ和BglⅡ消化,琼脂糖凝胶电泳分析。结果CE病人分离株标本的PCR扩增产物均不能被限制性内切酶SspⅠ酶切,为细粒棘球绦虫;其中43例病人分离株标本的PCR扩增产物不能被限制性内切酶BglⅡ酶切,鉴定为细粒棘球绦虫G1基因型;1例病人的分离株标本PCR扩增产物被BglⅡ酶切成158bp和403bp两条DNA条带,鉴定为细粒棘球绦虫G6基因型,证明G6基因型也能感染人体,因而对人具有致病性。实验结果证实PCR-RFLP对细粒棘球绦虫的基因鉴别与DNA序列分析鉴别结果完全一致,是一种简单快速有效的细粒棘球绦虫基因型检测方法。第四部分囊型包虫病人的血清学诊断与临床分析对包虫病诊断主要以影像学检查为依据,但血清学检测对包虫病早期诊断和流行病学调查具有重要意义。本研究应用ELISA和Immunoblotting方法对31例手术确诊的囊型包虫病人血清进行了回顾性检测与临床分析,探讨rAgB对囊型包虫病的诊断价值。结果表明rAgBELISA和Immunoblotting对CE病人血清检测的阳性率均为90.3%(28/31),有较高的诊断价值。其中3例CE病人血清学检测阴性,均为初次诊断为CE及单纯性肝脏单发感染的病人,对其血清学效价和包囊个数进行统计分析,发现血清学效价随着包囊的数目而增加,但t检验无显著性差异(t-test:P＞0.05),可能与单纯性肝脏单发感染包虫病人血清抗体水平相对较低有关,由于检测包虫病例数较少,尚需进一步的大样本比较研究。