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癌症是目前影响人类健康的几大疾病之一,全球新增癌症患者及死亡病例近一半出现在中国。多年来,手术治疗、放射治疗、化学药物(细胞毒药物)治疗是肿瘤治疗的三个主要手段。但是,化疗药物缺乏组织特异性,它同时也会杀伤正常的组织细胞,产生系统毒性。化疗药物在肿瘤治疗过程中产生的耐药性,也是导致化疗失败的主要原因。近年来,诞生了以肿瘤特征性标志成分(肿瘤标志物)为靶点的靶向治疗药物。免疫毒素(Immunotoxins)是一类典型的肿瘤靶向治疗药物,它是利用肿瘤标志物的单克隆抗体或配体与肿瘤细胞的特异性亲和能力,将与之偶联的毒素分子定向输送到靶点并攻击肿瘤细胞,对机体的正常的组织、细胞毒性较小。免疫毒素主要由3个结构域组成:毒素分子结构域、连杆结构域及靶向结构域。免疫毒素的靶向结构域主要为单克隆抗体或肿瘤细胞表面过表达的受体的配体。单克隆抗体能与肿瘤细胞免疫亲和,可以用作靶向结构域部分,但其分子量较大,且对肿瘤组织渗透能力较弱,易产生免疫原性。配体分子同样能够将与之偶联的毒素分子靶向性输送到肿瘤细胞表面,起到特异性杀伤作用。可作为载体的配体主要有白介素系列、肿瘤坏死因子和表皮生长因子等。配体分子具有分子量低、免疫原性弱、肿瘤组织穿透力强、循环半衰期短、基因操作方便的优点。目前,部分免疫毒素在临床试验及应用中表现出了良好的疗效,并且使用剂量低、系统非特异毒性弱。但由于毒素结构域多来自于细菌毒素,由此引发的高免疫原性仍是临床应用的瓶颈。主要体现在肿瘤患者长期、多次用药后,体内可能产生中和免疫毒素的抗体,从而削弱免疫毒素的抗肿瘤疗效,甚至中断临床用药。Onconase是从北美豹蛙卵母细胞及早期受精卵中分离、纯化出的一种分子量为12k Da的蛋白,具有抗肿瘤作用,已在美国和欧州部分国家获得临床批件,用于间皮瘤的治疗。在长期临床应用过程中呈现出如下优点:可以诱导肿瘤细胞凋亡、可以识别间皮瘤等几种肿瘤细胞、不易产生耐药性、致敏性低、免疫原性低、副反应较轻、无刺激性,这些特点决定了Onconase具有良好的成药性和临床开发前景。为进一步提高Onconase对于非“间皮瘤”肿瘤细胞靶向性从而增加其应用范围及作用疗效,本实验选择低免疫原性毒素分子Onconase与配体型靶向结构域V3构成重组免疫毒素Onc-V3,以柔链(GGGGSGGGGSGGGGS)为连杆,以期取得较原始Onconase疗效更高、毒副作用更低的抗肿瘤药物。本实验中,我们通过构建重组表达质粒p GAPZαA-Onc-V3,表达了具有Rnase酶活性的重组免疫毒素Onc-V3,并通过一系列体外实验初步探讨了Onc-V3的抗肿瘤作用及作用机制。第一部分:重组表达质粒p GAPZαA-Onc-V3的构建。根据毕赤酵母偏爱密码子,构建表达质粒p GAPZαA-Onc-V3,电转化至毕赤酵母X-33中,通过抗生素筛选、Tricine电泳及PCR鉴定,得到可稳定遗传的含有重组质粒p GAPZαA-Onc-V3的多拷贝毕赤酵母工程菌,并确定了毕赤酵母X-33电转化的最佳条件,0.2cm电转杯、1.1k V、200Ω、25μF。进行了Western Blot鉴定,并测定了Onc-V3的Rnase活性,从而进一步证明重组免疫毒素Onc-V3能够在毕赤酵母X-33中正确表达。对含有目的蛋白Onc-V3的培养液进行了纯化,初步确定重组免疫毒素Onc-V3的纯化步骤。第二部分:重组免疫毒素Onc-V3的表达条件优化。通过测定培养基的碳源、氮源、p H和培养温度对重组蛋白Onc-V3表达的影响,筛选出重组免疫毒素Onc-V3的最佳摇瓶表达条件,即碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨(Peptone)、培养基初始p H为6.5-7.0、温度为27-30℃。通过响应面分析确定培养液中葡萄糖及蛋白胨的含量对于目的蛋白Onc-V3的产量有显著影响,温度对目的蛋白Onc-V3的表达产量有影响。对Onc-V3的摇瓶发酵响应面优化结果为因素A碳源(葡萄糖)为21.6g/L,因素B氮源(蛋白胨)为22.25g/L,温度27℃,p H 6.5。收率较优化前提高24%。以此发酵条件,采用50升发酵罐发酵工程菌Onc4,发酵液经离心、硫酸铵沉淀、透析除盐、亲和层析、凝胶过滤层析后,得酶活性为4161U/L的Onc-V3蛋白溶液,回收率为25.7%。第三部分:重组免疫毒素Onc-V3的抗肿瘤作用及机制。Onc-V3溶血实验结果表明Onc-V3浓度为100μM时基本无溶血,此浓度是细胞毒实验平均IC50浓度(0.19~0.38μM)的200多倍。用含Onc-V3的培养基培养HEK293细胞48h,结果显示Onc-V3对HEK293细胞无明显的抑制作用,具有较好的安全性。MTT实验结果显示Onc-V3对A549细胞、Hep G2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞及HO-8910PM细胞具有较好抑制作用,不同细胞株其IC50不同,从0.19μM到0.38μM。结果表明Onc-V3对于多种肿瘤细胞具有抑制作用,其效果优于原始Onconase。本实验用Mito Tracker®Red CMXR标记线粒体、Hochest 33342标记细胞核作为参照,用激光共聚焦显微镜观察FITC-Onc-V3分子发出的绿色荧光。结果显示HO-8910PM细胞内可见散在的线粒体颗粒被染为红色,环绕在被Hochest 33342染为蓝色弥散状细胞核周围。绿色荧光的FITC-Onc-V3蛋白分子与呈红色荧光的线粒体都位于细胞质中,说明Onc-V3分子可以靶向肿瘤细胞、进入细胞质从而发挥作用。以HO-8910PM细胞制作细胞爬片后,用含0.4μM Onc-V3培养基处理48h,经DAPI染色后置于荧光显微镜下观察,可见细胞核皱缩,并聚集成颗粒状、线状。说明在Onc-V3的作用下,HO-8910PM细胞发生了凋亡,细胞核固缩。流式细胞仪检测Onc-V3处理后的肿瘤细胞结果显示,Onc-V3作用后的HO-8910PM细胞发生了凋亡,不同剂量Onc-V3作用下的HO-8910PM细胞凋亡率不同,呈明显剂量依赖性,在剂量达到1.60μM时可达90%的凋亡率。用高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM细胞进行伤口愈合实验及Transwell侵袭实验验证Onc-V3对于HO-8910PM细胞迁移和侵袭的影响。结果显示高浓度Onc-V3对于HO-8910PM细胞的迁移及对基底膜的侵袭有抑制作用。Western Blot实验检测发现在Onc-V3诱导肿瘤细胞凋亡过程中,PARP、procaspase-9及procaspase-3含量明显降低,而PARP被切割产生的碎片含量随Onc-V3剂量增加而变多,caspase-9及caspase-3含量增加,表明Onc-V3可以通过Caspase途径诱导肿瘤细胞凋亡,与文献报道一致。综上所述,本研究成功构建了重组质粒p GAPZαA-Onc-V3,在毕赤酵母X-33中表达了重组免疫毒素Onc-V3,在体外实验中系统地研究了Onc-V3对肿瘤细胞的抑制作用,初步阐明了Onc-V3抗肿瘤作用机制。本研究证实Onc-V3对多种肿瘤细胞具有靶向性和杀伤性,为Onc-V3的进一步研究及应用奠定基础。