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胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是一种人类常见的高度恶性的消化系统肿瘤,多数患者确诊时已进展至晚期。胰腺星形细胞(Pancreatic stellate cells,PSCs)作为一种特殊的肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblast,CAF)在PDAC中异常活化并促进PDAC细胞增殖、侵袭、迁移以及诱导肿瘤细胞耐药,但有关PSCs影响PDAC细胞恶性生物学行为机制的研究十分有限。越来越多证据表明,CAFs可通过释放外泌体微小RNA(MicroRNA,miRNA)对肿瘤细胞生物学行为进行调节。文献报道,具有促癌作用的miR-21在PDAC活化的PSCs外泌体中显著上调。我们通过癌症和肿瘤基因图谱(The cancer genome atlas,TCGA)数据库分析发现高水平miR-21与胰腺癌患者淋巴结转移、肿瘤复发及更短的生存期密切相关。然而,PSCs来源的外泌体miR-21调节PDAC生物学行为的潜在机制尚不明确。因此,本研究第一部分在细胞水平探讨了 PSCs外泌体中miR-21对PDAC细胞迁移能力的影响及其可能的机制;此外,为了发现与PDAC患者预后相关的新的分子标志物,本研究第二部分结合PDAC患者临床资料,重点探讨了应激相关内质网蛋白1(Stress associated endoplasmic reticulum protein 1,SERP1)在胰腺癌患者预后判断中的潜在价值。两部分研究旨在为PSCs外泌体介导的PDAC转移研究提供初步的理论基础,同时探索PDAC患者潜在的预后标志物。第一部分胰腺星形细胞外泌体miR-21对胰腺癌细胞迁移能力的影响及机制1.文献报道胰腺癌PSCs外泌体中miR-21相对水平显著上调,生物信息学方法进一步分析miR-21对PDAC进展的影响及潜在机制。结果发现miR-21高表达的患者具有更高的T和N分期,同时具有更短的总生存期(Overall survival,OS)和无病生存期(Disease-free survival,DFS)。KEGG分析发现miR-21的靶基因主要参与调节Ras和Erk信号通路,TCGA数据库中基因突变数据显示PDAC患者中K-ras基因突变频率高达91%,Ras信号通路过度活化。因此,数据库分析结果提示PSCs释放的高水平miR-21可能通过参与Ras信号通路活化促进胰腺癌进展。2.胰腺癌PSCs及肿瘤细胞(PANC-1、AsPC-1和MIAPaCa-2)外泌体miR-21表达水平被定量分析。首先利用手术切除的新鲜胰腺癌组织在体外培养原代PSCs,然后经超速离心法收集PSCs培养基中的外泌体,透射电子显微镜和western blot对外泌体进行鉴定。实时定量PCR分析发现,活化PSCs外泌体中miR-21相对水平高于PANC-1、AsPC-1、MIAPaCa-2以及经全反式维甲酸(All-trans-retinoicacid,ATRA)去活化的PSCs,结果证实胰腺癌PSCs中具有较高水平的miR-21。3.为观察PSCs外泌体miR-21能否被肿瘤细胞摄取,在体外,用PKH67绿色荧光染料标记PSCs外泌体并孵育PANC-1和MIAPaCa-2细胞,3小时后,荧光显微镜观察到标记有绿色荧光的外泌体已进入肿瘤细胞内部。接下来,qRT-PCR进一步分析肿瘤细胞中miR-21相对水平,结果发现与未处理的细胞相比,外泌体处理后的肿瘤细胞中miR-21相对水平显著上调,证实PSCs细胞外泌体中miR-21能被PDAC细胞摄取。4.为观察PSCs外泌体miR-21对PDAC细胞恶性表型的影响,首先用PSCs外泌体处理PANC-1和MIAPaCa-2细胞,PSCs来源的外泌体能够明显增强细胞迁移能力。Western blot和明胶酶谱实验发现PSCs外泌体处理后的PDAC细胞,上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关指标表达水平发生改变,同时基质金属蛋白酶2和9(Matrix metalloprotein 2 and 9,MMP-2/9)活性增强。为明确PSCs外泌体促进肿瘤细胞迁移及增强EMT的能力是否由miR-21所介导,miR-21 inhibitor被转染至活化的PSCs中抑制其内源性miR-21表达,然后收集外泌体处理PDAC细胞,结果下调PSCs外泌体中miR-21水平后可明显逆转外泌体介导的细胞迁移及EMT过程,同时还可降低PDAC细胞中MMP-2/9 活性。5.根据生物信息学分析结果,western blot证实PSCs外泌体miR-21可上调PDAC细胞中Ras、磷酸化Erk及磷酸化Akt表达水平。蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析发现 Ras 和 Erk 信号通路中 RAS p21 蛋白激活子 1(RAS p21 protein activator 1,RASA1)是一个关键基因,既是 miR-21的关键靶基因,又是Ras信号通路的负调节因子。Western blot结果也证实PSCs外泌体miR-21可通过下调肿瘤细胞中RASA1表达促进Ras/Erk/Akt通路活化。6.经转录因子活性芯片初筛发现,信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在活化 PSCs 中的活性是经 ATRA诱导去活化PSCs活性的10倍。由于STAT3是miR-21的转录因子,在活化PSCs中转染si-STAT3下调STAT3表达后,活化PSCs中内源性miR-21相对水平下降,其外泌体中miR-21水平也相应下调。第二部分SERP1与胰腺导管腺癌患者预后间关系及其在调节细胞凋亡中作用1.GEO数据库(Gene expression omnibus,GEO)下载PDAC患者癌及癌旁组织表达谱芯片数据,利用R语言分析差异表达mRNA。与癌旁组织相比,SERP1 mRNA水平在PDAC组织中显著上调。通过分析人类蛋白质图谱数据库(Human protein atlas,HPA)中PDAC患者免疫组化数据,发现PDAC组织中SERP1的蛋白表达水平也显著高于癌旁组织。组织芯片的免疫组化结果进一步证实SERP1在PDAC中表达水平显著上调。2.从TCGA数据库获得SERP1 mRNA表达数据及患者临床资料,根据mRNA表达水平的中位数将PDAC患者分为SERP1高表达组和SERP1低表达组,分析SERP1表达水平与PDAC患者预后间关系。随着SERP1 mRNA表达水平的升高,患者临床分期越高,特别是T和N分期;Kaplan-Meier(K-M)生存分析发现SERP1高表达患者具有更短的OS和DFS;Cox比例风险模型(Cox proportional-hazards model,也称为Cox回归)分析发现SERP1表达水平是影响PDAC患者OS及DFS的独立预后因素。3.基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)结果证实SERP1高表达与细胞凋亡有关;蛋白质间相互作用(Protein-protein interaction,PPI)和基因本体(Gene ontology,GO)分析发现 SERP1 与 SRP 受体 β 亚基(SRP receptor beta subunit,SRPRB)/NF-κB信号通路有关;相关性分析发现SERP1 mRNA水平与NF-κB正相关,SRPRB mRNA水平与NF-κB负相关。4.转染si-SERP1下调PANC-1细胞中SERP1表达,肿瘤细胞凋亡率明显增加。Western blot证实下调SERP1表达可以增加SRPRB表达,SRPRB过表达可以抑制NF-κB活化,最终促进细胞凋亡。本研究第一部分结果表明,活化的PSCs中转录因子STAT3活性增强可以上调miR-21水平,内源性miR-21经外泌体释放到胞外被临近PDAC细胞摄取,通过靶向RASA1促进Ras/Erk及Ras/Akt信号通路活化并增强肿瘤细胞迁移能力。本研究第二部分结果表明,SERP1高表达与PDAC患者更高的临床分期以及更短的生存期相关,下调SERP1表达水平可以增加SRPRB表达进而抑制NF-κB信号通路活化,最终促进PANC-1细胞凋亡。因此,SERP1有望成为PDAC患者一个新的潜在预后标志物,通过靶向SERP1可以诱导肿瘤细胞凋亡。