研究背景人体内尿酸(Uric acid, UA)是嘌呤代谢的终产物,是人体血液中重要的缓冲盐,人类因尿酸酶基因突变失活,尿酸不能继续降解而使血尿酸水平较其它哺乳动物高。以往研究认为尿酸是一种抗氧化物质,对心脏、血管及神经细胞等起到一定的保护作用,然而近年来对于尿酸的认识正在发生着颠覆性的变化。目前研究发现,高浓度尿酸不仅失去其抗氧化的保护作用,反而可以诱导细胞内氧化应激的发生,从而导致肾小管上皮细胞、胰岛细胞、肝细胞、内皮细胞等多种细胞损伤及功能障碍。临床研究也证实高尿酸血症与高脂血症、糖尿病、肥胖等危险因素一样,是导致急性心肌梗塞(AMI)、心衰、高血压等多种心血管疾病(CVD)的独立危险因素,利用黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂来降低血浆尿酸水平的治疗能改善内皮细胞功能、降低胰岛素抵抗及系统性炎症,从而使合并心血管疾病的患者及无症状的高尿酸血症患者受益研究表明尿酸可以诱导肾小管上皮细胞、胰岛细胞、肝细胞及内皮细胞等多种细胞凋亡增加及增殖下降,但在不同细胞中,引起细胞损伤所需的尿酸浓度不尽相同。2014年美国风湿病协会建议：目标血清UA水平为6mg/dl,合并其他危险因素的患者或严重痛风患者目标血清UA水平应低于6mg/dl,但在我们的临床工作中对无症状高尿酸血症的早期干预的重视严重不足。其原因一方面由于临床上血尿酸水平的升高往往是无症状的,多是在查体时发现,或者伴发痛风性关节炎、痛风性肾病时才被诊断；另一方面,是由于低浓度尿酸对细胞无损伤作用,可能还具有一定的保护作用,高浓度尿酸才会导致内皮细胞损伤,对造成内皮细胞损伤的尿酸浓度的阈值尚无定论。因此,在本研究中我们利用体外培养的原代人脐静脉内皮细胞建立尿酸损伤模型,观察不同浓度尿酸对体外培养的内皮细胞增殖、凋亡及NO生成能力的影响,为高尿酸血症的早期临床干预提供可借鉴的理论依据。研究目的1.体外原代培养人脐静脉内皮细胞,建立尿酸损伤的细胞模型。2.验证不同浓度尿酸对体外培养的血管内皮细胞活性的影响,筛选出能够导致内皮细胞损伤的尿酸浓度。研究方法1.细胞培养原代培养的HUVECs购自德国PromoCell公司,采用内皮细胞生长培养基(EGM)进行传代培养,每日相差倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,选取生长良好的的3-5代细胞用于实验。2.细胞鉴定将HUVEC传代至激光共聚焦专用培养皿,24h后免疫荧光染色及流式细胞仪检测细胞表面标记物Von Willebrand factor(vWF).CD31及Smooth muscle alpha-actin(α-SMA)、的表达,对原代培养细胞进行鉴定。3.细胞增殖检测将HUVEC传代至96孔板,24h后更换含有不同浓度尿酸的培养液(Omg/dl、4mg/m1、6mg/ml、9mg/m1、12mg/m1),诱导12h、24h及48h时,MTT法检测细胞增殖情况。4.细胞凋亡检测将HUVEC传代至6孔板,24h后更换含有不同浓度尿酸的培养液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/m1.12mg/m1),分别在尿酸诱导前及诱导后12h、24h及48h收集细胞,利用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对细胞进行染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.NO含量检测将HUVEC传代至6孔板,24h后更换含有不同浓度尿酸的培养液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml),分别在尿酸诱导前及诱导后12h、24h及48h收集细胞培养的上清液,硝酸还原酶法测定细胞培养液上清中NO的含量。6.统计学分析本文实验数据均以mean±S D表示。采用SPSS 19.0软件行One-way ANOVA分析,组间两两比较采用SNK-q test分析,以P<0.05作为差异有显著意义,P<0.01作为差异有高度显著性意义。研究结果1.人脐静脉内皮细胞的体外原代培养及鉴定体外原代培养的HUVEC形态不规则、扁平、呈椭圆形、梭形或多角形,细胞单层融合时呈典型“铺路石”样外观,体外传代至第6代时细胞形态及生长规律未见明显变化。免疫荧光染色及流式细胞仪检测结果均显示原代培养的HUVECs中内皮细胞标志物vWF及CD31表达阳性,成纤维细胞标志物α-SMA表达阴性,符合内皮细胞特征。2.不同浓度尿酸对细胞增殖的影响MTT结果显示,与对照组比较,4mg/d1及6mg/d1尿酸刺激后12h、24h及48h细胞增殖均未见明显变化,9mg/d1尿酸刺激48h出现细胞增殖能力下降,12mg/d1尿酸刺激24h开始出现细胞增殖能力下降。3.不同浓度尿酸对细胞凋亡的影响凋亡检测结果显示,与对照组比较,4mg/d1尿酸刺激12h、24h及48h细胞凋亡均未见明显变化,6m/d1尿酸刺激48h细胞凋亡增加,9mg/d1尿酸刺激24h开始出现细胞凋亡增加,12mg/d1尿酸刺激12h即出现细胞凋亡增加,且呈时间依赖性增加。4.不同浓度尿酸对细胞NO生成能力的影响NO检测结果显示,与对照组比较,4mg/d1尿酸刺激后各个时间点细胞上清液中NO含量均未见明显变化,6mg/d1尿酸刺激48h细胞上清液中NO含量减少,9mg/d1及12mg/d1尿酸刺激后12h均开始出现细胞上清液中NO含量减少,且呈时间依赖性减少。结论1.在体外培养的原代HUVEC中,4mg/d1尿酸对细胞凋亡及增殖无明显影响。2.浓度高于6mg/d1时尿酸可呈浓度及时间依赖性的诱导凋亡并抑制HUVEC增殖。3.浓度高于6mg/d1时尿酸呈浓度及时间依赖性的诱导HUVEC NO生成减少,导致内皮细胞功能障碍。研究背景内皮细胞功能障碍是多种心血管疾病发生发展的基础,而血管内皮功能障碍最突出的表现是NO含量的减少和生物活性的降低。研究显示高尿酸可使内皮细胞中ROS含量迅速增加,eNOS活性下降,NO释放减少,导致内皮细胞功能障碍的发生,然而其作用机制并未阐明。在高尿酸大鼠模型中,大鼠血管内皮细胞泡沫样水肿,部分内皮细胞从血管壁上脱落,细胞间隙扩大,管壁处炎细胞聚集,管壁增厚。内质网应激是一种在进化上高度保守的细胞反应机制,缺氧、氧化应激反应等均可触发内皮细胞的内质网应激的发生。适度的内质网应激有利于增强处理未折叠蛋白或错误折叠蛋白的能力,促进钙稳态的恢复,持续而严重的内质网应激可明显上调CHOP和ATF-6表达,诱导内质网途径的细胞凋亡,并可通过激活PKC.AKT等信号通路影响细胞活性及诱导炎症反应的发生。研究发现高UA导致肾小球系膜细胞、肝细胞发生氧化应激并触发内质网应激。在内皮细胞中,同型半胱氨酸硫内酯、尿素、ox-LDL等多种刺激因素均通过诱发氧化应激、内质网应激导致内皮细胞功能障碍,高尿酸导致的内皮细胞氧化应激反应,是否会导致内质网途径的细胞凋亡及功能障碍目前尚未见有报道。研究目的1.观察高浓度尿酸诱导后细胞内ROS含量、内质网应激标志物的表达,探讨氧化应激、内质网应激在尿酸诱导的内皮细胞损伤中的作用。2.检测高浓度尿酸诱导后NO生成相关因子及信号通路的表达变化,并探讨高尿酸导致内皮细胞功能障碍的机制。研究方法1.尿酸诱导及药物预处理体外原代培养的HUVECs接种培养板后24h,更换含有尿酸的EGM,分别置入37℃细胞培养箱内继续培养不同时间。进行药理学干预时,在尿酸诱导前分别给予氧清除剂PEG-SOD(100 U/ml)、内质网应激缓解剂4PBA(10 mM)及PKC抑制剂polymyxin B(20μg/ml)预处理30min,在尿酸诱导后不同时间分别收集细胞。2.细胞内ROS含量的检测体外原代培养的HUVECs接种培养板后24h,更换含有12mg/dl尿酸的EGM,分别置入37℃细胞培养箱内继续培养3h、6h、12h、24h,利用特异性CM-H2DCFDA探针检测细胞内ROS含量。3.Western blotting检测HUVECs接种培养板后24h,更换含有12mg/d1尿酸的EGM,分别在培养3h、6h、12h、24h时收集细胞,提取细胞总蛋白,western blotting检测CHOP、ATF-6、Caspase-12、eNOS、PKC蛋白表达,及eNOS、PKC的磷酸化水平。4.免疫沉淀法检测eNOS/CaM的相互作用HUVECs接种培养板后24h,更换含有12mg/d1尿酸的EGM,分别在培养3h、6h、12h、24h时收集细胞,提取细胞总蛋白,利用eNOS抗体与抗原结合,并与protein A琼脂糖珠耦联后沉淀的原理,使eNOS及与之结合的蛋白共同沉淀,联合western blotting可以检测出与eNOS结合的CaM蛋白含量,间接反应eNOS/CaM的相互作用。5.胞浆钙离子浓度检测HUVECs接种培养板,尿酸诱导3h.6h.12h.24h时,采用钙离子特异性荧光探针Fluo-3 AM染色,荧光显微镜下观察胞浆内钙离子浓度变化。6.eNOS活性及NO生成的检测尿酸诱导前分别给予活性氧清除剂PEG-SOD,内质网应激缓解剂4PBA,PKC抑制剂polymyxin B预处理,尿酸诱导48h收集细胞及细胞培养的上清液,对细胞内eNOS活性及细胞上清液中NO含量进行检测。7.统计学分析本文实验数据均以mean±SD表示。采用SPSS19.0软件行One-way ANOVA分析,组间两两比较采用SNK-qtest分析,以P<0.05作为差异有显著意义,P<0.01作为差异有高度显著性意义。研究结果1.高浓度尿酸对细胞内ROS生成的影响与对照组比较,高浓度尿酸(12mg/d1)刺激后3h开始检测到细胞内ROS生成增多,在12h达到高峰,24h时持续高表达。100U/ml PEG-SOD预处理能有效抑制尿酸导致的ROS生成增加。2.高浓度尿酸对细胞内质网应激的影响结果显示,与对照组比较,尿酸诱导后6h开始检测到细胞内质网应激标志物ATF-6、CHOP表达增加,在12h达到高峰；12h开始检测到内质网途径凋亡因子caspase-12表达增加,24h达到高峰。PEG-SOD(100U/ml)及4PBA(10 mM)均能有效抑制UA诱导的ATF6、CHOP及caspase-12表达增加。3.氧清除剂及内质网应激抑制剂拮抗尿酸导致的细胞凋亡及NO生成减少结果显示,与对照组比较,UA(12mg/d1)刺激48h后,细胞凋亡明显增加、NO生成明显减少；抗氧化剂PEG-SOD(100U/ml)及内质网应激抑制剂4PBA(10 mM)均可有效抑制UA导致的凋亡增加及NO生成减少4.尿酸通过增加Thr495位点的磷酸化降低eNOS活性尿酸刺激后各个时间点,细胞内CaM蛋白表达量、胞浆钙离子浓度、eNOS总蛋白表达量均未见明显改变。进一步对eNOS的磷酸化水平进行检测,结果显示尿酸刺激后eNOS-Ser1177位点的磷酸化水平无明显变化,eNOS-Thr495位点的磷酸化水平明显增加。免疫沉淀结果显示,尿酸刺激后与eNOS结合的CaM明显减少,提示eNOS/CaM的相互作用减弱。5.尿酸通过内质网应激/PKC信号通路降低eNOS活性结果显示：PKC总蛋白含量在尿酸刺激后6h,12h及24h均无明显变化,p-PKC蛋白含量在尿酸刺激6h开始增加,12h达到高峰；PEG-SOD.4PBA预处理可有效抑制UA诱导的PKC磷酸化增加。PEG-SOD.4PBA polymyxin B均能够抑制UA诱导的eNOS Thr495位点的磷酸化水平增加及eNOS活性下降。结论1.高尿酸可诱导HUVEC发生氧化应激,并启动内质网应激的发生,诱发内质网途径的细胞凋亡。2.高尿酸诱导后HUVEC内eNOS在Thr495位点磷酸化增加,降低eNOS与CaM的相互作用,导致eNOS活性下降,NO释放减少。3.高尿酸诱导的内质网应激通过激活PKC信号通路调控eNOS活性4.内质网应激抑制剂能够有效拮抗高尿酸诱导的内皮细胞功能障碍。