目的:冠心病是严重危害人类健康的疾病,随着国人生活和饮食习惯的改变,该病的发病率和死亡率也逐年上升。冠状动脉旁路移植术(CABG)是目前外科治疗冠心病的主要方法,它可以明显改善患者生活质量和延长寿命。乳内动脉和大隐静脉是目前CABG的主要材料,其中大隐静脉的使用最为常见,但术后大隐静脉的远期通畅率并不能令人满意。研究表明应用大隐静脉行CABG后第一年有12-27%的静脉移植物闭塞,5年后其阻塞率为25-31%,以后阻塞率以每年2-4%的速度增长,术后10年有48-66%的静脉移植物完全阻塞,并因此有大约10%的患者需重新手术。因此,如何防治CABG术后移植静脉再狭窄一直是学者研究的热点。环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)又名前列腺素内过氧化物合成酶,是一种膜结合蛋白,具有环氧合酶和过氧化物合成酶双重酶的功能,是体内花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandin,PG)的关键酶。医学上对COX的认识源于对疼痛和炎症的研究,COX是炎症的重要介质前列腺素生物合成的关键酶。人们在研究中发现,COX有两种异构体,即COX-1、COX-2,前者为结构型酶,主要分布于内质网,参与机体正常的生理过程与功能,而后者为诱导型酶,多分布于内质网和核膜,在基础水平表达极低,而在炎症等刺激情况下表达成倍增长。自发现COX抑制剂阿司匹林对动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)相关疾病有防治作用后,COX与炎症反应密切相关的同工酶COX-2成为关注的焦点。多年的研究证实,AS的病理生理过程也是一种慢性炎症反应的过程,其本质为炎症性疾病,系统监测炎症标志物的变化已经成为AS相关疾病现代防治的一大进展。目前,已有的研究发现了COX-2参与动脉粥样硬化的证据。采用逆转录聚合酶链反应法对人类AS斑块的分子生物学研究发现,AS部位血管的COX-2 mRNA表达是正常血管对照的4.8倍,而COX-1 mRNA表达仅为正常对照的1.1倍。采用免疫组织化学染色发现人类AS病变的各细胞成份均有大量COX-2蛋白表达,而在无AS病变的正常血管壁无表达。同时,有研究发现COX-2不仅参与AS的形成,而且可能在其发生、发展和转归过程中均具有重要影响。而在研究兔动脉球囊扩张损伤的动物实验时发现,损伤动脉平滑肌细胞中的COX-2 mRNA的表达水平明显高于正常对照组,而COX-2选择性抑制剂可抑制它的表达;并且,使用COX-2选择性抑制剂可以减轻实验中血管球囊扩张损伤后的炎症反应及内膜增殖。冠状动脉旁路移植术(CABG)后移植静脉的再狭窄,表现为移植静脉血管内膜及平滑肌的增殖,晚期也表现为粥样硬化。据此,我们假设,COX-2在移植静脉再狭窄模型中会明显表达增高,并且,COX-2的表达与静脉的再狭窄过程相关。据此假设,我们进行本课题的研究。研究目的有:①以兔为实验动物建立稳定的自体移植静脉模型,证实COX-2在移植静脉中会有明显的表达异常;②原代培养出兔静脉血管内皮及平滑肌细胞,并可连续传代,满足体外实验需要;③建立有效的RNA干扰系统,可在细胞实验中高效特异的抑制兔静脉细胞COX-2的表达;④使用RNAi技术及COX-2特异性抑制剂在细胞实验中检测COX-2的表达情况与兔静脉血管内皮及平滑肌细胞的增殖过程的相关性;⑤通过使用COX-2特异性抑制剂,在动物实验中证实干预COX-2的表达可以影响移植静脉增生、狭窄的进程。方法:1、研究COX-2在兔自体移植静脉血管壁中的表达情况取新西兰大白兔(体重2.2～2.5kg)24只,雌雄不限,随机分成3组,每组8只。耳缘静脉注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉后,以“Cuff”套管法行单侧颈外静脉-颈总动脉自体移植手术。术后前三天每12小时肌注青霉素20万U,皮下注射肝素钠1mg/kg。三组兔分别于术后2周、8周、12周麻醉后取移植静脉及对侧颈外静脉标本作自身对照。每个标本分成两部分,一半行免疫组化染色;一半保存于液氮中,备实时定量PCR使用。研究观察:①镜下观察静脉切片免疫组化染色差异;②通过提取静脉标本总RNA,反转录后行实时定量PCR检测,量化的反应组织中COX-2的表达情况。2、兔静脉内皮、平滑肌细胞的培养新西兰大白兔麻醉后取下腔静脉作为细胞培养组织。分离血管时尽量剥尽外膜,血管取下后快速使用37℃预热的生理盐水漂洗尽血液,暂存于37℃无血清培养基中,移至无菌操作台。拟行平滑肌细胞培养的静脉血管,先将其翻转后置于0.1%Ⅰ型胶原酶中,37℃孵育20分钟后充分漂洗,去除内皮细胞,将血管剪成长约1～2mm的小段,再沿血管纵向将其剪成两半,将血管面展开后行贴块法培养,培养基为M199(含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml)。拟行内皮细胞培养的静脉血管,直接将其剪成长约1～2mm的小段,再沿血管纵向将其剪成两半,将血管面展开后行贴块法培养,培养基为RPMI-1640(含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、肝素100μg/ml、胰岛素10μg/ml、氢化可的松10μg/ml)。细胞传代培养后根据形态学观察确定为平滑肌细胞或内皮细胞,同时行a平滑肌肌动蛋白(a-SMA)及Ⅷ因子免疫组化方法鉴定其来源。3、体外干预兔静脉内皮、平滑肌细胞COX-2的表达,观察其对细胞增长的影响首先,应用EGFP报告基因体外筛选干扰兔COX-2较有效的siRNA位点;然后,使用选出的siRNA片段及已知的COX-2抑制剂NS-398体外干预兔静脉内皮及平滑肌细胞COX-2的表达,检测其对细胞生长的影响。检测指标有:①免疫组化染色;②MTT法测细胞数;③流式细胞仪测细胞周期;④流式细胞仪检测细胞凋亡率;⑤实时定量PCR测COX-2 mRNA的表达情况;⑥免疫印迹法(westernblot)检测COX-2、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况。4、COX-2抑制剂对兔自体移植静脉血管壁重构的影响取新西兰大白兔(体重2.2～2.5kg)48只,雌雄不限。随机分成3组,每组16只,每组兔子再随机分为对照组及实验组两组,每组8只。均行自体颈外静脉-颈总动脉移植手术。术后前三天每12小时肌注青霉素20万U,皮下注射肝素钠1mg/kg,实验组每日灌胃给予COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)一次,剂量为5mg/kg。三组兔分别于术后2周、8周、12周麻醉后取移植静脉检测。每个标本分成两部分,一半行免疫组化染色;一半保存于液氮中,备实时定量PCR使用。检测指标有:①HE、VB染色,光镜下测量血管壁内膜、中膜厚度;②免疫组化染色观察不同组静脉阳性染色程度差异;③提取标本总RNA,反转录后行实时定量PCR检测,量化比较各组COX-2mRNA表达的差异。结果:1、证实COX-2在移植静脉中表达明显增高镜下观察免疫组化切片标本发现,正常静脉无明显阳性染色,而三个时间点的移植静脉切片标本均呈强阳性染色。实时定量PCR反应显示,移植静脉中COX-2mRNA表达明显增高。2、成功培养出兔静脉内皮、平滑肌细胞,并可连续传代先行消化去内皮细胞的静脉血管,通过贴块法使用M199(含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml)培养,5天左右可见组织周围有长梭形细胞爬出,9天左右细胞成片生长,呈单层束状,排列紧密。按1∶2的比例传代后40分钟左右细胞开始贴壁,3～5天可铺满培养皿底70～80%,形态特征与原代基本相同,再予按1∶2的比例传代。细胞形态与文献报道血管平滑肌细胞形态相同,细胞可持续传代10代以上。以a-SMA(a平滑肌肌动蛋白)免疫组化染色为阳性,证实为平滑肌细胞。以RPMI-1640(含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、肝素100μg/ml、胰岛素10μg/ml、氢化可的松10μg/ml)为培养基贴块培养的静脉组织,在4～7天左右可见组织块周围有多边形、椭圆形细胞爬出,9～11天左右细胞成片生长,呈铺路石样排列,少量出现重叠生长,予按1∶3的比例传代。细胞传代后约1小时开始贴壁,3天左右可铺满培养皿底70～80%,形态特征与原代基本相同,再予按1∶3的比例传代。细胞形态与文献报道血管内皮细胞形态相同,细胞可持续传代10代以上。以Ⅷ因子免疫组化染色为阳性,证实为内皮细胞。3、证实在体外抑制COX-2的表达可抑制兔静脉内皮及平滑肌细胞的增殖本部分实验成功筛选出有效的兔COX-2干扰位点。使用RNA干扰及COX-2抑制剂体外抑制COX-2的表达。免疫组化染色检测发现使用RNA干扰及COX-2抑制剂均可抑制细胞COX-2的表达。MTT法检测发现,使用RNA干扰及COX-2抑制剂均可抑制静脉细胞的增殖。流式细胞仪检测细胞周期结果显示,使用RNA干扰及COX-2抑制剂均使细胞停留于G1期的比例增多,而S期细胞比例减少,显示细胞增殖受抑制,差异有统计学意义。流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示:使用COX-2抑制剂组细胞凋亡率明显上升,而RNA干扰组细胞凋亡率较对照组稍有升高,但与RNA干扰的对照组没有明显差异,考虑RNA干扰组的细胞凋亡由转染脂质体引起,干扰COX-2 mRNA本身并不诱导细胞凋亡。实时定量PCR结果显示,使用RNA干扰及COX-2抑制剂均使COX-2 mRNA的表达降低。免疫印迹法(westernblot)检测显示:使用RNA干扰及COX-2抑制剂均可抑制COX-2蛋白的表达;COX-2抑制剂组细胞Bcl-2蛋白表达下降,Caspase-3蛋白表达升高,RNA干扰组Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达与对照相比无明显差异。4、证实使用COX-2抑制剂可以影响兔自体移植静脉血管壁增殖的进程取各时间点移植静脉标本行HE、VB染色,光镜下测量血管壁内膜及中膜厚度,结果显示:移植后2周的标本,内膜、中膜层均可见明显增厚,对照组增厚较实验组明显,差异具有统计学意义;移植后8周的标本,可见移植静脉内膜及中膜均明显增厚,且都以对照组增厚明显;移植后12周标本,可见内膜厚度较8周时减少,中膜继续增厚,内膜及中膜的增厚程度均以对照组为重。结论:1、COX-2在正常静脉中呈低表达,而在动脉化的移植静脉中呈明显的高表达。2、建立简单有效的原代培养兔静脉内皮及平滑肌细胞的方法,且所得细胞可以连续传代,满足实验所需。3、应用EGFP报告基因可在体外成功筛选干扰兔COX-2的较有效siRNA位点。4、体外使用RNA干扰技术及COX-2特异性抑制剂NS-398均可抑制兔静脉内皮及平滑肌细胞COX-2 mRNA的表达,并可抑制静脉细胞增殖。5、使用COX-2抑制剂可诱导体外培养的静脉细胞凋亡,而使用RNA干扰技术抑制COX-2的表达并不增加静脉细胞的凋亡。6、在兔自体颈外静脉移植模型中,使用COX-2特异性抑制剂,可以抑制移植静脉局部COX-2的表达,并可减缓移植静脉血管壁的增殖。综上所述,COX-2在移植静脉中会明显表达增高,其表达情况与移植静脉血管壁的增生进程相关;抑制COX-2的表达,可以影响移植静脉血管内膜及中膜的增生,可以减缓移植静脉狭窄的进程。