1研究背景急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭,其病理特征为由于肺微血管通透性增高、肺泡渗出物富含蛋白质的液体,进而导致肺水肿及透明膜的形成,其病理生理改变时肺容量的减少、肺顺应性的降低和严重的通气血流比例失调,临床表现为呼吸窘迫和严重的低氧血症。暴露于危险因素的患者,发病率极高,早在1995年,Hudson[1]等发表了关于脓毒症和创伤患者7天内发生ARDS的发病率为100%的研究报道。随着诊疗水平的提高,ARDS的发病率及死亡率稍有下降。然而,本病起病急骤,发展迅猛,预后极差,一直是医疗界的难题。炎症反应失控和氧化应激损伤是ARDS重要的发病机制。细菌性和病毒性肺炎是ARDS最常见的原因。其中,革兰氏阴性细菌性肺炎所致的脓毒症休克更易引起ARDS。革兰氏阴性细菌表面的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)通过与体内单核-巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等细胞膜上的受体结合,启动细胞炎症反应,导致多种细胞因子如肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、白细胞介素-1β(interleukine-1β, IL-1β)和IL-6等大量生成。这些因子进一步作用到其他细胞,引起炎症反应扩大,最终形成ARDS病人和动物的血清和肺泡灌洗液中TNF-α水平显著升高,TNF-α是启动和放大炎症反应的关键介质。其血清中的表达量与疾病的进展、预后密切相关[6]。ARDS小鼠模型中,炎症和氧化应激水平正相关,肺组织活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平高的小鼠,肺部损伤更严重[7]。Syrkina[8]等研究发现,ARDS小鼠早期即出现氧化与抗氧化失衡,抗氧化剂乙酰半胱氨酸能抑制ARDS小鼠肺内还原型谷胱甘肽的下降,减轻中性粒细胞浸润,降低肺泡灌洗液中炎症因子的水平,减少气道结构细胞凋亡。本实验室前期研究和国外报道均发现,抑制TNF-α表达能减轻RDS小鼠的氧化应激损伤。肺上皮细胞,是肺脏结构和功能的基础,尤其是Ⅱ型肺泡上皮细胞,对肺泡内水份的清除能力,损伤后的修复能力,以及对其生长、分化的调节在ARDS的进展和转归中起着重要作用。氧化应激发生后,过量的ROS产生可以损伤肺泡上皮细胞,破坏上皮屏障功能,导致疾病进展。本实验室前期研究表明,用TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,能够在体外模拟ARDS过度炎症反应和氧化应激的病理生理特点。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase, Nox)是催化生成ROS重要的酶,内源性的ROS主要由Nox催化产生,一方面,它的产物ROS能参与正常的生理功能,包括机体免疫、信号转导及生化反应；另一方面,又能与DNA、蛋白质、类脂化合物等生物分子发生化学反应并破坏其结构。小鼠肺泡上皮细胞主要表κNoxK Nox2、Nox4,其中,Nox1在ROS产生及上皮功能破坏中作用最为突出。研究表明TNF-a能通过上调Nox基因的从而增加细胞ROS水平,也有研究显示Nox1基因沉默可以降低TNF-a预处理的平滑肌细胞内的ROS水平。有关于肠道粘膜炎症的研究中,Nox1蛋白表达的增加,催化的ROS生成增多,从而导致炎症因子的表达上调,诱导了肠粘膜细胞凋亡。因此,研究Nox1的表达调控,是研究ROS导致氧化应激损伤的基础。基因转录水平调控是基因表达最关键的步骤。Kuwano [1等分析肠粘膜炎症性疾病发现：TNF-a活化肠上皮细胞中Noxl的亚Noxol,从而使ROS的表达量达对照组的9倍,牛Noxol5’端序列截短后构建萤光素酶表达载体发现,在-585至-452bp之间存在着TNF-α相关的启动子活化区域,该区域的AP1位点对于TNF-α介导的Noxl表达有重要调控作用。Manea等进一步证实了AP1对于Noxl的表达具有转录调控作用。NF-κB是重要的转录因子,抑制转录因子NF-κB能显著下调TNF-α介导的Nox1的表达,并降低ROS水平,这与本实验室前期研究结果相同。然而,本实验室沉默NF-κB,Nox1表达仅部分下调,因此我们大胆猜测还有其他转录因子共同作用于Nox1的表达调控。转录因子SP1是作用广泛的转录因子之一,通过结合于目的基因的启动子序列,SP1能发挥促进细胞生长、胚胎发育和肿瘤发生发展等作用。研究发现SP1参与了TNF-α介导的众多基因表达的转录调控。本研究发现SP1与Nox1在TNF-α介导的肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤中表达同时增加。而且,生物信息学分析发现,Nox1基因翻译起始位点上游存在多个SP1转录因子结合位点。因此,我们进一步假设：TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中,SP1是Noxl的一个重要的转录因子,通过与Nox1启动子结合调控其表达。2研究目的评估TNF-α相关的肺泡上皮细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的表达水平及相互关系；探讨转录因子SP1在TNF-α介导的Nox1活化中的表达调控作用及机制。3方法3.1沉默Nox1对A549细胞中TNF-α介导的ROS水平的影响3.1.1TNF-α介导的A549细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的表达水平根据TNF-α预处理浓度不同将实验分为Ong/mL、10ng/mL、25ng/mL,50ng/mL4个组(本课题除转染时TNF-α刺激时间为18h,其余所有实验TNF-α刺激时间为24h)。分别用RT-PCR、Western-blot检测检测A549细胞Nox1mRNA和蛋白水平的表达。ROS荧光探针DCFH-DA检测A549细胞ROS表达水平。3.1.2TNF-α介导的A549细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的相互关系实验分组为：Nox1沉默组、沉默阴性对照组、Noxl沉默+TNF-α (50ng/mL)组、沉默阴性对照+TNF-α (50ng/mL)组。用RT-PCR检测沉默效率,ROS荧光探针DCFH-DA检测Noxl沉默后A549细胞的ROS表达水平。3.2转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Noxl的转录调控3.2.1TNF-a介导的A549细胞氧化损伤中,SP1的表达水平根据TNF-a预处理浓度不同将实验分为Ong/mL、10ng/mL、50ng/mL4组。RT-PCR、Western-blot分别检测检测A549细胞的SPlmRNA和蛋白水平表达。3.2.2TNF-a介导的A549细胞氧化损伤中,SP1对Noxl的转录调控将实验分为SP1沉默组、沉默阴性对照组、SP1沉默+TNF-α (50ng/mL)组、沉默阴性对照+TNF-α (50ng/mL)组。RT-PCR检测SP1沉默效率及沉默后A549细胞的Nox1mRNA水平。3.3Noxl启动子重要调控区域的鉴定3.3.1Noxl启动子萤光素酶表达载体的构建以正常人全血基因组DNA为模板,PCR扩增Noxl翻译起始位点上游1415bp片段,并设计引物,继续扩增1415bp内,以翻译起始位点上游第1位碱基开始逐渐延长的5个启动子片段,连接到pGL3-Basic表达载体,进行酶切和测序验证。3.3.2Noxl启动子截短片段萤光素酶表达载体的活性鉴定质粒转染分为TNF-a刺激(50ng/mL)和未刺激两组,每组按照启动子的长短分为pGL3-Basic、pGL3-143/ATG、pGL3-192/ATG、pGL3-401/ATG、 pGL3-534/ATG、pGL3-947/ATG、pGL3-1415/ATG共7个亚组(整个实验中DNA片段长短未包括保护性碱基和酶切位点的长度,以翻译起始位点为+1,翻译起始位点上游的序列为其负值,如-500是翻译起始位点的前第500位碱基)。与海肾内对照质粒pRL-TK共同瞬时转染真核细胞,双萤光素酶报告系统检测相对萤光素酶活性。3.4SP1参与Nox1转录调控的机制研究3.4.1缺失SP1结合位点的Nox1启动子萤光素酶表达载体的构建根据启动子截短片段的活性,翻译起始位点上游-534～-401范围内存在Nox1启动子的重要调控区域。其内存在2个SP1结合位点,利用重叠PCR缺失2个SP1位点所在的38bp,连接到pGL3-Basic,命名为pGL3-1377/ATG,进行酶切和测序验证。3.4.2缺失SP1结合位点的Noxl启动子萤光素酶活性检测实验分为pGL3-1377/ATG.pGL3-1415/ATG、pGL3-1377/ATG+TNF-α (50ng/mL).pGL3.1415/ATG+TNF-α(50ng/mL).pGL3-1377/ATCr+TNF-α (50ng/mL)+SPlsiRNA、pGL3-1415/ATG+TNF-a(50ng/mL)+SPlsiRNA6组,瞬时转染A549细胞,双萤光素酶报告系统检测相对萤光素酶活性。3.4.3EMSA检测SP1位点的蛋白结合能力38bp包括2个SPl(-439--430bp；-427---418bp).1个GATA-1(-443--434bp).1个Oct-1(-418--409bp).因此需要设计凝胶电泳迁移实验(EMSA)明确SPl结合位点的结合能力。实验分组为1：阴性对照组,2：样品反应组,3：探针冷竞争反应组,4：突变探针的冷竞争反应组,5：SP1-1组,6：SPl-2组,7：GATA-1,8：Oct-1组。其中,1-4组EMSA反应中加入的为缺失片段(38bp)探针,5-8组的探针分别为缺失片段上截取的的转录因子结合位点序列。3.5统计学方法采用spss13.0软件包进行统计学分析,计量资料数据以均数士标准差(X±s)表示。不同浓度TNF-α刺激A549细胞后的Nox1和SPlmRNA、蛋白表达及ROS水平用单因素方差分析。首先进行方差齐性和总体组间差异检验,总体有差异后,进行多重比较,方差齐用LSD,方差不齐用Tamhane检验。涉及转染siRNA或DNA质粒及TNF-α刺激等多个处理因素的实验中,统计学方法采用析因分析,P<0.05有统计学差异。4结果4.1沉默Nox1对A549细胞中TNF-α介导的ROS水平的影响4.1.1TNF-α介导的A549细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的表达水平单因素方差分析结果显示,不同浓度TNF-α刺激的A549细胞, NoxlmRNA,Nox1蛋白、ROS表达水平有统计学差异(F=742.2, P<0.000;F=596.398,P<0.000;F=374.945,P<0.000)。多重比较结果提示,每两组之间均有统计学差异(所有P值均小于0.000),从均值看,Ong/mL组低于10ng/mL组,10ng/mL组低于25ng/mL组,25ng/mL组低于5Ong/mL组,随着TNF-α浓度增高,NoxlmRNA,Nox1蛋白、ROS表达水平随之增高。4.1.2Nox1沉默效率检测及Nox1沉默对ROS水平的影响Nox1沉默组Nox1表达下降73%,提示沉默效率可用于后续实验。析因分析结果提示：TNF-α刺激后,NoxlmRNA表达水平有显著差异(F=346.966,P<0.000),TNF-α刺激的A549细胞ROS水平有显著差异(F=286.485,P<0.000),刺激组ROS水平(493.000±7.722)显著高于对照组(308.167±7.722),Nox1沉默和沉默对照组,TNF-α刺激均能导致ROS的显著性差异(t=-6.117,P=0.005；t=-17.361,P<0.000)。4.2转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Nox1的转录调控4.2.1SP1mRNA, SP1蛋白水平检测单因素方差分析结果显示,各组A549细胞SP1mRNA和蛋白表达水平有统计学差异(F=516.52, P<0.000; F=520.333, P＜0.000).多重比较结果提示,每两组之间均有统计学差异(所有P值均小于0.000))。从均值看,Ong/mL低于10ng/mL组,10ng/mL低于25ng/mL组,25ng/mL低于50ng/mL组,随着TNF-α浓度增高,SP1蛋白水平相应增高。4.2.2SP1沉默验证SP1siRNA瞬时转染A549细胞,提取RNA进行沉默效率验证。在TNF-a(50ng/mL)处理组与未处理组,SP1siRNA均能下调SP1%的表达70%,沉默效率可用于后续实验。析因分析结果显示TNF-a能显著上调SPlmlRNA水平(F=1962.083,P<0.000), TNF-a组SP1mRNA表达(均数为0.924±0.665)显著高于对照组(均数为0.547±0.037)。4.2.3SP1沉默对NoxlmRNA表达的影响析因分析结果显示：SP1沉默与沉默对照之间NoxlmRNA水平有显著差异(F=12.401,P=0.008),在TNF-a未刺激组和刺激组,SP1沉默与沉默对照比较均有统计学差异t-8.349, P=0.00h;=-2.999, P=0.04)。TNF-α (50ng/mL)处理细胞后,NoxlmRNA水平有显著差异(F=5228.510,P<0.000),在SP1沉默与沉默阴性对照组,TNF-a (50ng/mL)均能显著上调NoxlmRNA的表达(t=-41.237P=0.001, t=-70.298P<0.000)。4.3Noxl启动子重要调控区域的鉴定4.3.1通过酶切及测序验证,截短启动子片段的萤光素酶表达载体pGL3-Noxl构建成功；4.3.2pGL3-401/ATG与pGL3-534/ATG比较萤光素酶活性增加有统计学差异,TNF-a后同样有统计学差异；4.3.3转染pGL3-Noxl后,TNF-a刺激能增强pGL3-534/ATG，pGL3-947/ATG, pGL3-1415/ATG组萤光素酶活性。4.4SPl参与Noxl转录调控的机制研究4.4.1构建缺失SP1位点的重组质粒pGL3-1377/ATG通过酶切和测序验证,上部分实验中Noxl启动子重要调控区域SP1结合位点缺失的重组质粒pGL3-1377/ATG构建成功,相比pGL3-1415/ATG,缺失了预计的38bp。4.4.2缺失SP1位点对萤光素酶活性的影响析因分析结果提示：缺失38bp片段对Nox1启动子活性影响有统计学差异(F=84.459,P<0.000),pGL3-1377/ATG组萤光素酶活性(均数为35.857±2.537)低于pGL3-1415/ATG(均数45.357±3.629),提示38bp内存在较重要的启动子调控区域。加入TNF-a刺激后,pGL3-1377/ATG和pGL3-1415/ATG萤光素酶活性增加均有统计学差异(P<0.000)。转染SPlSiRNA对pGL3-1377/ATG组萤光素酶活性影响无统计学差异(F=0.617,P=0.0549),pGL3-1415/ATG组转染SPlsiRNA萤光素酶活性变化有统计学差异(F=4.565,P=0.001)。4.4.3SP1位点的蛋白结合能力按照生物信息学分析,Noxl启动子重要调控区域的38bp存在包括SP1在内的4个转录因子结合位点,构建了该4个结合位点的EMSA探针,结果提示,-427--418bp的SP1结合位点能结合转录因子,其余3个位点不具有生物学活性。5结论Noxl是TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中内源性ROS的重要催化酶；SP1是TNF-α介导的氧化损伤中Nox1活化的一个重要转录因子；SP1对Nox1转录调控机制的阐明为ARDS过程中炎症继发氧化应激损伤的机制研究奠定基础。