论文部分内容阅读
随着规模化、集约化养猪业的发展、饲养管理水平的提高以及防疫能力的加强，过去曾严重危害养猪业发展的一些烈性传染病如猪瘟等已得到基本控制，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）等所引起的繁殖障碍类疾病对集约化猪场的危害则显得越来越严重，已成为制约我国养猪业发展的一类重要疾病。研制并使用安全、效果可靠的多联疫苗是当前养猪业迫切需要解决的问题。因此，本试验进行了如下基础研究。 PRRSV LX-1株的分离鉴定及其E-M-N基因cDNA的克隆与序列分析：用Marc-145细胞从病料中分离获得一株病毒，经间接荧光抗体试验、电镜观察和RT-PCR确定为PRRSV，将其命名LX-1株；根据《兽用新生物制品管理办法》和《兽用生物制品规程》要求完成了分离病毒系统鉴定的主要指标内容；根据VR-2332株全基因组核苷酸序列设计引物，对PRRSV LX-1株和PRRSV疫苗克隆株LY-1株的三个与免疫相关的主要结构蛋白基因——E、M、N基因进行RT-PCR扩增并进行序列测定。分析结果表明，LX-1株E-M-N cDNA的核苷酸序列与美洲株VR-2332同源性为99.8％，与LY-1株的同源性为99.3％，且在N基因上均无差异；与欧洲型LV株的同源性为66.6％，证实分离获得的LX-1株的基因型为美洲型。对所推导的氨基酸序列的同源性及抗原位点进行比较结果表明，LX-1株与美洲型毒株和LY-1株无明显差异，与欧洲型毒株差异较大；免疫保护性试验也说明，弱毒疫苗克隆株LY-1株能有效保护免疫猪群免受LX-1株的攻击。 PRV LY株的分离及其gD基因的克隆与序列分析；为了确切地对繁殖障碍类疾病作出分类诊断，了解当地毒株的基因背景并建立生产用疫苗候选毒株，本研究还对送检病料进行了PRV的分离培养，获得了多株PRV病毒，并进行了血清中和试验、电镜观察及PCR扩增等系统的鉴定。对部分分离株（如PRV LY株和PRV LA株）按《兽用新生物制品管理办法》和《规程》要求进行了实验室免疫等主要指标的实验内容。其中PRV LY株对3日龄乳鼠和家兔有一定的致病力，但对仔、乳猪及妊娠母猪都有很高的安全性，能使免疫仔猪、妊娠母猪及其后代在30日龄内抵抗105.7TCID50强毒的攻击。以上试验结果说明，PRV LY株可能是一弱毒株，而且具有很好的免疫保护作用。对PRV LY株gD基因扩增产物的序列测定与分析结果表明，PRV LY株与Kaplan株的核苷酸及推导氨基酸序列的同源性分别为99.5％和96.3％，与Rice株、EA株等的核苷酸和推导氨基酸序列同源性也均高于98.0％和96.0％，从分子水平上进一步证实所分离的病毒为PRV，明确了两株病毒gD基因的背景，对于确定毒株来源和分子流行病学特点具有重要意义。 PRRSV和PRV核酸疫苗的构建与实验免疫研究：将PRRSV LX-1株的E、N基因和PRV LY株的gD基因分别克隆到pIERES1neo、pEGFP-C1载体中，成功构建了含有相应目的基因的单基因核酸疫苗质粒：PRRSV的pIE、pGE、pIN和pGN；PRV的pIgD、pFgD，以及含有PRRSV E基因和PRV gD基因的双基因共表达二联核酸疫苗质粒pID-E。用脂质体介导技术将构建的上述核酸疫苗质粒分别转染BHK一21细胞，并进行间接EIJISA检测。结果表明，目的基因均获得了表达，而且表达产物均具有特异的反应原性;各质粒以50叫只剂量分别对20只BalB/C小鼠的免疫实验结果显示，质粒PIE、PlgD、PID一E均能诱导小鼠产生特异性免疫反应，其中pIE在三次免疫后小鼠的血清阳性转化率为100%。PlgD组在第二次免疫后，抗体检测均为阳性，在第三次免疫后抗体水平持续升高，抗体中和指数为141。其中的双基因共表达二联核酸疫苗质粒PID一E能诱导免疫小鼠产生中和PRRSv和P盯的抗体，三次免疫后对P双Sv和P卿的中和指数分别为58和一26。当pIE与PlgD的联合应用时能同时诱导小鼠产生各自的特异性抗体，与单独免疫时无显著差异，血清中和指数分别为63和162，说明两质粒所诱导的免疫彼此无干扰现象，PRRSv的PIE可以与PRV的plgD联合应用，而不影响各质粒特异性抗体的产生，为进一步研究P双Sv Lx一1株E、M、N基因和PRvLY株gD基因的免疫特性奠定了试验基础。 PRRSVN基因在原核系统中的高效表达与初步应用研究:将PRRSV LX一1株N基因克隆到原核表达质粒pET28b（+）中，成功构建了原核表达载体pET28N。pET28N转化受体菌￡。011 BLZ一（nE3），经IPTG诱导、sDS一队GE电泳，在.1 8.6kDa处可见一条蛋白表达带;经Westem blot检测，该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应，说明具有一定的反应原性:薄层扫描表明表达蛋白占菌体总蛋白的54.1%。同时，首次应用p一半乳糖代替IPTG成功诱导了pET28N在E.coli BLZI旧E3)中的高效表达，薄层扫描表明表达蛋白占菌体总蛋白的41.1%。用包涵体免疫BALB/c小鼠和豚鼠，经Westem blot和ELISA检测，表明该表达蛋白具有很强的免疫原性。经间接ELIsA检测，纯化后的表达蛋白作包被抗原可与PRRSV阳性血清发生特异反应，与已知参考血清的反应结果与PRR.SV全病毒完全一致。对187份血清样品的对比检测结果表明，纯化的该表达蛋白作抗原的检测与PRRSV全病毒和重组抗原为包被抗原的ELISA试剂盒的符合率分别为93.60/0和98.9%，说明该表达蛋