细胞色素P450s(又简称CYPs或P450s)是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶,由于该酶在450nm处有最大紫外吸收峰,因此该类酶被命名为P450s,其广泛分布于生物体内,其中包括动物,植物,真菌,细菌和病毒等。P450一个重要功能就是参与药物I相代谢反应,它有广泛的底物来源,包括很多药物的活性成分,环境毒素,致癌物质和食品衍生化学物质等。另外一个重要功能就是参与很多内源化学物的生物合成,代谢和消除过程,比如类固醇激素,脂肪酸等。如上所述,P450s能催化许多化学反应的发生,包括脂肪族和芳香族化合物的羟基化反应,N-,O-,S-脱烷基化反应,脱氨基化反应,N-O,C-O,C-N键氧化反应,环氧化反应,歧化反应和许多其他反应。细胞色素P450s是一个庞大的超级家族,根据特定的氨基酸序列同源性可分为18个家族(用阿拉伯数字数字1,2,3,4表示)和43个亚家族(用大写字母A,B,C,D表示)。其中,CYP2,CYP4家族的酶的数量明显高于其他16个家族。P450s主要分布于肝脏,同时在小肠,肾脏,肺和大脑中也有少量的分布表达。肝脏是人体的主要药物代谢器官,有9种主要的P450s,其中CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A4可以催化75%的药物代谢反应。本课题主要分为3部分:CYP8B1代谢鹅去氧胆酸代谢通路的研究;探索不同细胞色素还原系统对P450s的活性影响;胆固醇和类固醇代谢P450s的底物筛选和抑制剂探究。其中,对于CYP8B1,旨在研究CYP8B1转化鹅去氧胆酸为胆酸的可行性,把体内的胆固醇经典代谢通路连接起来;对于不同的细胞色素还原系统,旨在探究不同还原助手对3种微粒体P450s CYP3A4,CYP3A7和CYP17A1的活性影响;对于涉及胆固醇和类固醇代谢的7种P450s(CYP7A1,CYP7B1,CYP11A1,CYP27A1,CYP39A1,CYP46A1和CYP51A1),旨在研究其特异性底物的活性表征和抑制作用,从而为细胞色素P450研究领域提供更多的信息。本课题第一部分主要进行CYP8B1代谢鹅去氧胆酸的研究。CYP8B1是类固醇12α-羟化酶,参与胆汁酸生物合成的重要步骤,仅在肝脏中分布表达。由于它和前列环素合成酶CYP8A1具有43%的氨基酸同源序列,所以被命名为CYP8B1。近年来,许多研究人员以Cyb8b1基因敲除小鼠为模型研究Cyb8b1基因与疾病之间的关系,研究成果显示Cyb8b1基因敲除小鼠能够降低肠道中胆固醇的吸收并增加胆汁酸的生物合成,从而使它们免于高血脂症和胆结石的形成;胆固醇诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)Cyp8b1基因敲除小鼠模型的心脏代谢特征明显改善,这可能与粪便脂质和胆汁酸排泄增加有关,所以Cyb8b1基因可以对胆汁酸进行调节和预防小鼠的非酒精性脂肪肝病。这些发现提示选择性的CYP8B1抑制剂可能在治疗代谢疾病方面具有潜在的药理作用。但是关于CYP8B1的活性底物研究信息非常少,目前已知的CYP8B1底物只有7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮而CYP8B1的抑制剂至今还未被发现。CYP8B1参与胆汁酸生物合成的重要步骤,目前的学术观点认为CYP8B1通过代谢7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮的水平来调节体内鹅去氧胆酸(CDCA)和胆酸(CA)的平衡。鹅去氧胆酸(CDCA)和胆酸(CA)是人体中主要的两种胆汁酸,分别是胆固醇经典代谢通路的两个代谢终产物。胆汁酸是高效的生理洗涤剂,其作为胆汁中胆固醇的增溶剂和肠中脂质的乳化剂,还能促进胆固醇,脂质和其他疏水化合物在肝脏和肠道中的吸收,排泄和运输。我们课题组构建了可以重组表达CYP8B1的裂殖酵母菌种,并应用两种生物转化方法进行实验,分别为基于渗透处理的酵母细胞法(“酶包”法)和全细胞生物转化法。我们发现CYP8B1能催化鹅去氧胆酸(CDCA)代谢为胆酸(CA),并且“酶包”法的产物胆酸的转化率为全细胞法的26倍,这个结果再一次证明了“酶包”法是一个高效的生物转化方法。而且CYP8B1能催化鹅去氧胆酸(CDCA)代谢为胆酸(CA)这个发现使得胆固醇的两条代谢通路连接在一起,对胆汁酸代谢具有重要意义。我们又用“酶包”法测试了8种生物发光底物,其中5种都能被CYP8B1代谢,目前最好的底物是Luciferin-BE,然后为Luferin-PFBE,Luciferin-CEE和Luciferin-PPXE,代谢Luciferin-MEEGE的活性很弱;然而Luciferin-ME,Luciferin-H和Lucifeirn-MultiCYP不是CYP8B1的底物。这一研究成果拓展了CYP8B1的底物类型,发现了5种不同的脂肪族类羟基化反应。我们以Luciferin-CEE为底物对6种常见抑制剂进行了CYP8B1抑制实验,研究结果发现来曲唑,依西美坦,酮康唑,氨基苯并三唑抑制CYP8B1的活性在10%-20%之间,1-苄基咪唑和苯甲唑啉不是CYP8B1的抑制剂。据我们所知,尽管它们的抑制力和选择性都比较低,但这四个化合物是第一批被鉴定的CYP8B1抑制剂,它们的结构仍可作为开发对CYP8B1具有更好效力和更强特异性的抑制剂的起点。本课题的第二部分探索不同的还原助手对酶活性的影响。P450s的代谢依赖于氧化还原伙伴来传递电子,对于微粒体P450系统,细胞色素P450还原酶(POR或CPR),细胞色素b5(B5),NADH-细胞色素b5还原酶(B5R)负责电子传递;对于线粒体P450系统,皮质铁氧还原蛋白(Adx)和皮质铁氧还原蛋白还原酶(AdR)负责电子传递。我们课题组以裂殖酵母为载体构建了新的菌种,分别重组表达了不同还原助手和3种P450s(CYP3A4,CYP3A7,CYP17A1)。CYP3A4参与许多常用药物的代谢,包括几种大环内酯类抗生素,抗抑郁药和抗焦虑药,如阿普唑仑,咪达唑仑和地西泮等;CYP3A7与CYP3A4具有88%的序列同一性,CYP3A7的主要底物是脱氢表雄酮(DHEA)和DHEA-硫酸盐等;CYP17A1是类固醇17α-羟化酶和随后的17,20-裂解酶。我们采用基于渗透化处理的酵母细胞进行生物转化的方法进行实验。研究结果发现,在所有测试的底物中,CYP3A4和CYP3A7与CPR共表达的菌种的活性明显高于对照组(只表达CYP3A4或CYP3A7,不表达CPR),证明了CPR能显著提高P450s的活性。然后,测试了P450s与多种还原助手共表达菌种的活性。对于CYP3A4,当以Luciferin-IPA和Luciferin-BE作为测试底物时,CYP3A4和CPR-B5-B5R/B5R-B5-CPR共表达的菌种活性明显高于其他菌种(CYP3A4与CPR,CYP3A4与CPR-B5共表达)。对于CYP3A7,以Luciferin-BE和Luciferin-PFBE和Luciferin-PPXE作为测试底物时,CYP3A7和CPR-B5-B5R/B5R-B5-CPR共表达的菌种活性明显高于其他菌种(CYP3A7与CPR,CYP3A7与CPR-B5共表达)。然而当以黄体酮和孕烯醇酮测试CYP17A1的活性时,CYP17A1与CPR共表达的菌种的活性最强,与B5R-B5-CPR共表达的菌种反而活性降低。我们又对CPR进行了Q153R基因突变,CPR-Q153R与CYP17A1共表达菌种的活性低于CYP17A1与野生型CPR共表达菌的活性。所以我们认为B5和B5R只对CYP3A家族酶活性具有增强效果,对CYP17A1的活性没有增强效果;突变过后的CPR-Q153R并没有增强CYP17A1的酶活力。本课题的第三部分是探究胆固醇和类固醇代谢的7种P450s(CYP7A1,CYP7B1,CYP11A1,CYP27A1,CYP39A1,CYP46A1和CYP51A1)的特异性底物的活性表征和抑制作用。内源性胆固醇主要在肝脏中合成,转化为胆汁酸排泄,胆汁酸是胆固醇分解代谢的最终产物。CYP7A1是胆固醇7α-羟化酶和27-OH-胆固醇的7α-羟化酶;CYP7B1是类固醇7α-羟化酶;CYP11A1可以催化胆固醇转化为类固醇激素的起始步骤和限速步骤;CYP27A1是类固醇27-羟化酶和维生素D 25-羟化酶;CYP39A1是特异性24-羟基胆固醇7α-羟化酶;CYP46A1是胆固醇24-羟化酶;CYP51A1通过催化羊毛甾醇的14α-去甲基化而参与胆固醇生物合成。这部分我们课题组pan-CYP课题的一部分,旨在为人体57种P450s收集代谢活性和抑制作用的数据。由于P450s可以代谢大约90%市面上的药物,所以企业在新药研发的过程中不可避免的会涉及P450s的活性和抑制作用信息。例如在检测新药是否会由于P450s代谢而产生毒性代谢产物时,又或者在众多P450s当中筛选某个P450的抑制剂时,因此对57种P450s的活性底物和抑制剂信息的总结是十分必要的,从而可以随机混合几种P450s,利用“鸡尾酒法”快速筛选出其特异性的的底物和抑制剂,但迄今还未见相关的报道。我们课题组有全部的表达57种人P450s的裂殖酵母菌种,更具备了大量的发光底物和多种抑制剂,因此我们可以完成57种P450s的活性代谢与抑制作用信息的总结。我们采用两种化学发光底物(Luciferin-H和Luciferin-ME)进行活性实验和3种抑制剂(酮康唑、来曲唑、1-苄基咪唑)的进行抑制度的测定。通过我们的研究发现,Luciferin-ME能被CYP7A1和CYP39A1代谢;Luciferin-H不能被任何一个酶代谢。1-苄基咪唑抑制CYP7A1的活性在50%左右。综上所述,本文对于细胞色素P450s的活性代谢进行了一定程度的研究,课题一共分为3个部分,围绕不同P450s代谢生物活性底物和发光底物进行探究,丰富了P450s领域的研究内容。对于CYP8B1部分,我们发现CYP8B1能代谢鹅去氧胆酸代谢为胆酸,把胆固醇代谢的两条通路连接起来,并且我们还发现了5种CYP8B1的发光底物,把CYP8B1的底物由原来的1个扩展为了7个,为后续的抑制剂研究打下了一定基础。对于不同的还原助手对酶活性的影响,通过我们研究发现B5和B5R能够提高CYP3A家族的酶活性,拓宽了关于CYP3A家族的活性研究。对于涉及胆固醇和类固醇代谢的P450s的研究是我们课题组pan-CYP课题的一部分,我们发现了CYP7A1和CYP39A1能代谢Luciferin-ME,1-苄基咪唑是CYP7A1的抑制剂,为药物研发企业运行“鸡尾酒法”打下了一定的基础。