背景和目的膀胱癌在我国男性泌尿生殖系肿瘤中发病率最高，其中90％以上为膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder,TCCB)，因其具有高度遗传不稳定性、易复发性和常发生耐药而倍受重视[1]。肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，手术以及术后化学治疗是恶性肿瘤治疗主要手段之一[2]。膀胱移行细胞癌的在临床上死亡率较低，术后病人有很长的生存期，但其对化学治疗效果不敏感，多数病人需行二次或三次手术，严重者甚至需行全膀胱切除术，这就严重影响了病人的生活质量[3,4]。因此，研究膀胱癌的发病机制、复发机制以及耐药机制，对于降低膀胱癌的发生以及提高膀胱癌的治愈具有重要意义。以往大量的研究已经证明，膀胱癌的发生与人体DNA损伤修复能力降低有关，尤其与NER机制密切相关[5]。Zhiwen Chen等研究发现[6]，XPC在膀胱癌中低表达，而XPC是启动P73介导的凋亡机制的主要蛋白，XPC低表达不断导致DNA修复能力下降，同时导致细胞的凋亡能力下降，最终导致DNA突变积累，基因组不稳定性上升。Jin Yanget al研究表明[7]，XPC低表达协同P53变异影响膀胱癌的预后，XPC降低、P53变异率高的患者，其生存时间明显缩短。Silvia Saviozzi et al研究表明[8]，NER基因XPC、XPA在非小细胞肺癌中的表达降低，它们的低表达导致细胞DNA损伤识别能力和修复能力降低，最终参与了肺癌的发生。M Wang et al研究表明[9]，XPF在膀胱癌中表达降低，并且降低的XPF参与了膀胱癌的发生和复发。我们最新研究发现，XPA基因在膀胱癌中低表达，然而这种低表达的发生机制以及临床意义目前尚不清楚。XPA最初从着色性干皮病(xeroderma pigmentosum，XP)发现的，XP[10]最先是由匈牙利裔的皮肤病教授Kaposi等描述的。作为一种常染色体隐性遗传病，着色性干皮病的最主要特征是患者皮肤对阳光敏感并可在幼年发展为溃疡。随后几乎90%的病人会在十多岁发生基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等皮肤癌。在紫外线作用下，XP患者罹患皮肤癌的机率显著高于正常，约为正常人的1000倍。C1eaver等[11]首先发现该病是由于患者对紫外线照射造成的核苷酸损伤切除修复缺陷所致。到目前已有7组互补型及一种XP变异型被发现，与之相对应的基因分别被命名为XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG和XPV。XPA基因含有六个外显子，其中E1编码与RPA34结合部分，E2编码与ERCC1结合结构，E3编码锌指结构，E4和E5编码loop-rich subdomain，与DNA结合结构，E6编码TFIIH结构[12]。XPA与其他NER蛋白结合，在NER过程中发挥着复杂的作用，其中任何一个外显子发生变异，都将导致其功能丧失，进而导致NER效率降低。在XPA基因的六个外显子中，E3．E4/E5具有重要作用，NER机制生物效应的发挥，依赖XPA与DNA的结合能力以及结合方式，E3突变，导致其不能与DNA结合，则NER的后续反应不能继续发生。XPA是NER过程的限速蛋白。如果细胞中缺乏XPA蛋白，NER过程不可能发生。Beate Koberle et al等研究发现[13]：XPA-/-小鼠对UV以及顺铂的敏感性明显增高，而且由于不具备NER功能，不能够清除UV照射产生光产物，也不能够修复顺铂造成的DNA损伤，导致小鼠各种肿瘤的发生率明显上升研究发现。Gerdine J[14]等研究发现XPA蛋白在成纤维细胞中的量与NER效率明显相关，即XPA可能为NER机制的限速蛋白之一。很多研究证实，XPA除了上述作用之外，还具有DNA损伤识别的作用[15,19]。XPF同样是NER机制中重要的蛋白，具有5’端DNA内切酶的作用[16]。最新研究报道，XPF与ERCC1结合，在肿瘤的耐药性中发挥着关键性的作用[17]。此外，还有报道发现，XPF不仅仅在NER机制中发挥作用，同时还参与了DNA双链损伤修复，对各种化疗药物造成的DNA损伤（尤其是双链损伤剂如拓补异构酶抑制剂），具有直接修复作用[18]。鉴于XPA在NER机制中的重要作用以及XPA在膀胱癌组织中明显低表达这个现象，我们首先从研究XPA启动子多态性入手，逐步分析XPA多态性与膀胱癌进展之间的联系，XPA多态性与其表达之间的关系，进而分析XPA低表达与膀胱癌发生发展之间的相关性，最终明确XPA低表达与膀胱癌基因组不稳定性上升之间的联系。此外，在我们实验的第二部分，我们还初步研究了XPF与膀胱癌耐药性之间的联系。通过分析化疗组膀胱癌患者组织中XPF的表达和未化疗膀胱癌患者癌组织中XPF的表达，我们初步明确，XPF在膀胱癌对羟基喜树碱的耐药性中，发挥着一定的负面作用。方法：1．本研究首先利用RELF检测XPA A23G和G709A多态性，分析XPA多态性在膀胱癌人群和正常人群中的分布，明确XPA多态性与膀胱癌发生风险之间的关系。2．选择不同组的膀胱癌患者，采用病例对照研究分析XPA启动子多态性与XPA表达之间的联系、XPA多态性与膀胱癌发生和演进之间的联系、XPA低表达与膀胱癌发生和演进之间的联系，最终明确XPA在膀胱癌发生和进展中发挥的作用。3．通过临床病例对照研究，明确XPA低表达与膀胱癌基因组不稳定之间的联系，并采用siRNA干扰膀胱癌细胞株中XPA的表达，观察XPA低表达后，细胞对DNA损伤剂的反应。4．研究XPF与膀胱癌羟对羟基喜树碱耐药性之间的关系，并初步研究XPF升高后膀胱癌耐药性上升的发生机制。结果：（一）XPA多态性与膀胱癌易感性之间的关系（1）在膀胱癌患者和对照人群中，AA的基因型在正常人群中分布较高，在膀胱癌患者中分布较低，存在统计学差异（P<0.05）；（2）XPA启动子A23G基因型与膀胱癌的发生风险相关，AA基因型对膀胱癌的发生具有明显的保护作用，降低膀胱癌风险达到了28%。（3）吸烟是膀胱癌发生发展的重要因素之一。而且，吸烟能够降低XPA启动子A23G多态性A基因型对膀胱癌的保护作用。（二）XPAA23G多态性与XPA在膀胱癌中低表达之间的联系以及其对膀胱癌进程的影响（1）XPA启动子多态性基因型与XPA的表达具有相关性，A基因型对应的患者癌组织中XPA表达明显高于C基因型对应患者癌组织中XPA的表达（P<0.05）；（2）XPA启动子多态性与膀胱癌的复发具有一定的联系，A基因型对应的膀胱癌患者复发率要低于C基因型对应的膀胱癌患者的复发率（P<0.05）；（3）XPA表达水平与膀胱癌的复发具有一定的相关性，XPA低表达患者膀胱癌复发率高于XPA高表达患者膀胱癌的复发率；（4）吸烟作为一个独立因素，可以加重膀胱癌的复发（P<0.05）；（5）吸烟能够降低XPA启动子A23GA基因型对膀胱癌的保护作用。（三）XPA低表达加剧了膀胱癌基因组不稳定升高（1）D9S283、D9S303、D9S1751杂合性缺失在膀胱癌中的发生比率明显高于正常膀胱粘膜中的发生比率，这说明膀胱癌组织中基因组不稳定升高；（2）XPA低表达与膀胱癌组织中D9S283、D9S303、D9S1751杂合性缺失的发生具有相关性；（3）顺铂处理XPA干扰后的膀胱癌细胞株T24和5637，膀胱癌细胞株的凋亡率下降。（四）升高的XPF提高了膀胱癌患者对羟基喜树碱的耐药性（1）羟基喜树碱灌注组膀胱癌患者癌组织中XPF的表达明显升高（P<0.01）；（2）siRNA干扰XPF表达后，膀胱癌细胞株T24和5637对羟基喜树碱的敏感性升高；（3）顺铂刺激下，XPF降低能够启动细胞中内源性和外源性凋亡机制。结论和展望1．XPA启动子A23G多态性与膀胱癌发生风险以及进展相关；2．XPA启动子A23G多态性与膀胱癌组织中XPA的表达具有一定的联系，但并不能完全影响XPA的表达，这其中还有复杂的调控机制有待进一步研究；3．XPA低表达与膀胱癌的复发具有明显相关性；4．XPA低表达能够提升膀胱癌基因组不稳定性；5．XPF参与了膀胱癌对羟基喜树碱的耐药性，其机制可能与XPF启动凋亡途径相关；6．XPA低表达可能是膀胱癌发生过程中的早期事件，但其低表达的发生机制尚不明确，研究XPA低表达的发生机制，对于理解膀胱癌的发生具有一定的价值。