论文部分内容阅读
美达霉素是属于苯并异色烷醌(benzoisochromanequinones,BIQs)家族的一种芳香聚酮类抗生素,具有抗菌和抗肿瘤活性,能以新颖机制抑制多种癌症的信号传导。为了研究美达霉素的合成调控和高产菌育种,本研究以核糖体再循环因子和美达霉素生物合成基因簇上的新型调控基因med-ORF10为研究对象,利用遗传学、分子生物学和分析化学等多种手段,进行美达霉素高产菌株育种,并对med-ORF10的调控机制展开初步研究,具体内容如下:(1)、利用核糖体再循环因子进行美达霉素高产菌株的育种核糖体再循环因子涉及蛋白质生物合成的第四步核糖体的再循环,促进蛋白质的表达,可作为抗生素合成的正调控因子。美达霉素在其野生型产生菌链霉菌AM-7161中的产量非常低。本研究希望能通过在链霉菌AM-7161中过量表达核糖体再循环因子而缩短产素时间,提高美达霉素的产量。利用GenBank中的7种链霉菌核糖体再循环因子的碱基序列设计简并引物,以美达霉素产生菌链霉菌AM-7161基因组为模板,扩增frr基因,插入克隆载体pT7Blue,测序正确之后,与GenBank中的其他来源的核糖体再循环因子最高同源性为98%,说明我们克隆到了链霉菌AM-7161的核糖体再循环因子的基因序列,并将之投放到GenBank,获得序列号JF807993;将链霉菌AM-7161的核糖体再循环因子分别插入链霉菌高效表达载体pIJ8600和pWHM4*(质粒分别命名为pHSL56.2和pHSL56.3),经原生质体转化进入了野生菌链霉菌AM-7161中。首先通过固体培养检测发酵产物,发现重组菌AM-7161/pHSL56.2的固体培养基中产素(红褐色代表美达霉素的颜色)明显深于野生菌AM-7161。经液体发酵后,萃取发酵产物,然后经LC-MS/MS检测分析物发现美达霉素的产量提高了约3倍,其它代谢产物的量也有所增加。(2)、med-ORF10调控可能靶基因的表达和纯化前期实验初步确定了 med-ORF10参与美达霉素生物合成的调控,根据初步的转录分析推测med-ORF10调控的靶基因有med-ORF12和med-ORF1。与med-ORF10同源性最高的是放线紫红素生物合成基因簇上的基因actVI-ORFA,目前在actVI-ORFA的调控机制研究中,从转录和翻译两个水平上发现此蛋白可以影响一系列与放线紫红素生物合成中调控和后期修饰相关基因的表达。根据同源序列比对后推测,med-ORF10可能作用的靶点还可能有med-ORF30、med-ORF29、med-ORF28、med-ORF27、med-ORF23、med-ORF11、wmed-ORF6和med-ORF。本实验希望通过基因克隆、表达和纯化,制备多克隆抗体,以从翻译水平上检测其是否受到med-ORF10调控。首先以含有美达霉素基因簇的质粒pIK340为模板分别扩增这些可能的靶基因,将它们克隆入克隆载体pT7Blue(构建了系列克隆pHSL57.1(med-ORF30)、pHSL58.1(med-ORF29)、pHSL59.1(m d-ORF28)、pHSL60.1(med-ORF27)、pHSL61.1(med-ORF23)和pHSL62.1(med-ORF6))。测序正确之后再亚克隆至表达载体pET28a(+)(构建的系列克隆为 pHSL57.2(med-ORF30)、pHSL58.2(med-ORF29)、pHSL59.2(med-ORF28)、pHSL60.2(med-ORF27)、pHSL61.2(med-ORF23)和pHSL62.2(med-ORF6)。)ed-ORF11 和med-ORF5 直接克隆至 pET28a(+)中(命名为pHSL53.2和pHSL54)。分别将各表达质粒倒入大肠杆菌表达细胞BL21(DE3),建立多个基因的原核表达系统。经诱导条件的优化,我们表达并纯化各个目的蛋白。目前已成功纯化出5种目的蛋白(Med-ORF30、Med-ORF29、Med-ORF28、Med-ORF27 和 Med-ORF6)。(3)、med-ORF10 对med-ORF8 的调控作用med-ORF10的同源基因actVI-ORFA主要作用于放线紫红素合成途径中期的结构基因的表达,本章拟研究med-ORF10对美达霉素生物合成最后一步相关的结构基因是否有一定的调控作用。前期研究表明美达霉素基因簇中med-ORF8参与美达霉素生物合成中的最后一步,即能将安哥拉糖胺通过C-C糖苷键连接到受体上生成美达霉素。本研究希望通过表达纯化Med-ORF8后,制备多克隆抗体,检测在调控蛋白med-ORF10过表达的工程菌中糖基转移酶Med-ORF8表达量的变化。将med-ORF8亚克隆至表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)构建了原核表达系统BL21(DE3)/pHSL52。诱导表达发现Med-ORF8大量表达并以包涵体的形式存在,我们以尿素方法纯化,获得较高纯度的Med-ORF8;将纯化的Med-ORF8多次免疫新西兰大白兔后获得多克隆抗体,通过Western blot和ELISA分别检测抗体的特异性和效价都较高;利用制备的Med-ORF8的多克隆抗体检测野生菌及med-ORF10超量表达菌中med-ORF8的表达。Western blot结果显示在med-ORF10超量表达菌中med-ORF8的表达量略高于野生菌链霉菌AM-7161,表明med-ORF10可能对负责美达霉素生物合成最后一步的基因的表达也有一定的调控作用。