【摘 要】
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本实验为进一步研究不同果型山茱萸在分子水平的差异，收集了河南、浙江、陕西等主产地山茱萸各品种的叶片标本，用设计的引物扩增后分别测序，获得完整序列11份。主要结果如下：
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本实验为进一步研究不同果型山茱萸在分子水平的差异，收集了河南、浙江、陕西等主产地山茱萸各品种的叶片标本，用设计的引物扩增后分别测序，获得完整序列11份。主要结果如下：
1.在实验室确定的改良的CTAB法的基础上，对提取条件又进行了改进，建立了符合ITS序列分析的总DNA的提取方法，该法从1.0g山茱萸叶片中提取的总DNA收率为230μg/g～1499μg/g，经过琼脂糖电泳检测，紫外吸收检测表明，提取的总DNA杂质少、质量好，ITS扩增效果良好。
2.对扩增反应体系和温度循环参数进行了优化：
(1)50μl反应体系：其中10×buffer5μl，dNTP(2.5mM)6.0μl，Mg2+(25mM)6.0μl，引物(10μM)5μl，模板DNA(230μg/g～1499μg/g)6μl，Taq酶(5U/μl)2.5μl，去离子水14.5μl。扩增产物在1×TAE电泳缓冲液中用0.7％琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕用0.5μg/ml的EB染色，拍照。
(2)扩增程序：94℃预变性8min，94℃变性，1min，50℃退火，1min，72℃延伸，1min30sec，共35个循环。72℃10min补齐。其中变性94℃到退火50℃的降温和退火50℃到延伸72℃的升温均采用快速升降温。
3.利用软件Primerpremier5.0设计的一对ITS引物对所有样品进行扩增，扩增产物用DNAGelExtractionKit(AxyPrepTM)凝胶回收试剂盒纯化，送上海英骏生物技术有限公司，采用3730型测序仪测序。
4.测序结果采用DNAssistversion2.0和VectorNTIsuite7分析比对，获得了山茱萸ITS完全序列，ITS1为253bp，5.8S为156bp，ITS2为273bp，总共682bp。7种果型的山茱萸其5.8S基因序列显示高度的一致性，圆柱形果型、长梨形果型、椭圆形果型和纺锤形果型的ITS区序列完全一致，短圆柱形果型在ITS1区3端及ITS2区5端各有1个变异位点；短梨形果型在ITS1区5端有3个变异位点；长圆柱形果型在ITS1区有5个碱基不一致。提示不同果型的山茱萸在ITS区存在变异位点，为山茱萸的在分子水平的分析提供了理论依据。
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