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Era广泛分布于细菌、古细菌和真核生物中,是一个新的G蛋白亚家族。已有的研究结果显示,原核生物era是生存的必需基因,Era参与细胞周期调控和蛋白合成,是细菌生长必需的GTPase分子;真核生物Era的研究目前主要以人Era(hEra)为主,研究发现hEra在多种正常组织中表达,但其具体功能和确切机制还不清楚。因此,进一步研究Era的功能不仅有利于我们认识Era这一新的G蛋白亚家族,更能使我们对细胞生长和凋亡这样重要的生理过程有进一步的了解。hera基因(hera)位于人17号染色体长臂11.2,是我室陈苏民教授1999年克隆并定位的。2000年陈教授发现hera-mRNA存在两种不同的剪接方式:hEra和hEraII。我室前期主要研究hEraII的功能,发现hEraII与细胞生长和凋亡相关;本研究以hEra为主要研究对象,利用完全可诱导真核生物表达系统,对hEra在细胞生长、细胞周期和低浓度乙醇诱导细胞凋亡中的作用进行了研究。然后选取低浓度乙醇诱导细胞凋亡的常用实验材料肝癌细胞HepG2,对其hera RNAi后观察肿瘤细胞相关的生理变化。主要研究结果:1. hEra的功能与细胞生长和乙醇诱导的细胞凋亡相关。本实验采用的“完全可诱导哺乳类表达系统”由受体载体pERV3和可表达目的基因的表达载体pEGSH组成,在昆虫蜕皮激素的类似物Ponasterone A(Pon A)诱导下可表达目的基因。这个可调控表达系统具有高的诱导表达水平和快速开(turn on)关(turn off)效应等特点,是一种利用基因转导技术来研究基因功能的强有力手段。利用完全可诱导真核生物表达系统,我们将hEra在HEK293细胞中稳定转染,诱导稳定表达。细胞形态和生长曲线结果提示hEra的过表达能促进细胞生长,细胞周期检测显示野生型hEra能使G1期细胞降低,S期细胞增多;细胞同步化实验证明hEra的高表达促进细胞进入S期,使细胞在G1期持续时间缩短(诱导前为17.82 h,诱导后为14.13 h);Western blot实验说明hEra能上调cyclin D在蛋白水平的表达;用化学合成siRNA对hEra RNAi后HepG2细胞生长受到抑制。这些实验结果提示hEra可能通过间接上调cyclin D的蛋白表达来促进细胞快速进入S期,加快细胞生长和分裂进程。在我们建立的低浓度乙醇诱导细胞凋亡模型中,发现hEra的高表达能在一定程度上抑制低浓度乙醇诱导的细胞凋亡,而且可以上调c-jun的mRNA表达,下调促凋亡蛋白Bax的蛋白表达。提示hEra对低浓度乙醇诱导细胞凋亡的抑制与转录因子AP-1相关,这为下一步研究hEra的相关分子机制提供了线索。2. hEra N端在细胞生长分裂和乙醇诱导的细胞凋亡中起重要作用。为研究hEra N端的功能,我们构建了2种突变体:1种点突变hera S127N(对应于野生型人Era蛋白的G结构域)和1种截短突变hera 1-343(对应截短去掉人Era蛋白的C端KH结构域)。将其分别克隆于可诱导表达载体系统中,转染于已稳定转染受体载体pERV3的HEK293细胞,诱导表达后,观察对细胞的影响。我们观察到诱导表达的hEra N端GTPase结构域的完整表达即hEra 1-343也能促进细胞生长,但诱导表达的N端相应的单点突变体hEra S127N则不能,相应的细胞周期检测也印证了这一点,因此我们认为hEra N端GTPase结构域的完整对细胞的生长有积极意义。在低浓度乙醇诱导细胞凋亡的研究中,诱导表达的N端截短体hEra 1-343也能有效抑制乙醇诱导的细胞凋亡,而诱导表达的N端相应的单点突变体hEra S127N对这种凋亡没有抑制作用。说明hEra N端GTPase结构域的完整不仅对细胞的生长有积极意义,而且在抑制凋亡中也起重要作用。实验表明,诱导表达的hEra 1-343能上调c-jun mRNA的表达水平,下调c-myc的mRNA和促凋亡蛋白Bax的蛋白表达。提示hEra N端在体内可以独立行使某些生物学功能。3. hEra C端KH domain的活性在hEra的功能行使中可能起“锚定”作用。如结果2所述,用同样方法我们构建另2种突变体:hera I401N(对应于野生型人Era蛋白的KH结构域)和1种截短突变hera ?329(对应截短去掉人Era蛋白的N端GTP结构域)。将其分别克隆于可诱导表达载体系统中,转染于已稳定转染受体载体pERV3的HEK293细胞,诱导表达后,观察对细胞的影响。当hEra N端GTPase结构域完全缺失即只有KH结构域的截短体hEra ?329诱导表达时,细胞生长受到严重抑制,细胞周期检测在G2/M期发生阻滞,提示C端KH domain在hEra功能的行使中有重要作用,而且hEra对细胞的G2/M期也有一定影响。表明诱导表达的hEra ?329对细胞生长的抑制是hEra ?329对内源hEra的dominate negative效应。结合上述实验现象,我们推测:KH结构域是hEra行使功能的“锚定区”, GTP结合结构域是“催化区”。在GTP结构域发生突变时的点突变体hEra S127N中,KH结构域使突变的hEra仍然锚定在作用靶点,但GTP结合结构域不能行使功能,从而直接或间接影响细胞生长;当GTP结构域缺失后(即hEra ?329),KH结构域与内源hEra竞争结合作用靶点,使细胞生长受到严重抑制,细胞曲线明显右移。综合上述研究结果,我们认为hEra在功能上与细胞生长相关,其高表达能抑制低浓度乙醇引起的细胞凋亡。N端GTPase结构域在hEra发挥功能中起重要作用,C端的KH结构域在hEra发挥功能中可能起“锚定”作用。