MicroRNA (miRNA)是一类长度为22nt左右的内源非编码小RNA,进化上比较保守,广泛存在于动物、植物还有病毒等多种生物中。miRNA通过种子序列(第2-8个碱基)与靶基因mRNA的3’非翻译区(untranslational region, UTR)配对结合,进而实现其对基因表达的转录后调控。本论文对miRNA在病毒感染中的作用及miRNA调控自噬的机制进行了研究。研究发现,miRNA在病毒与宿主互作的过程中起关键作用。白斑综合症病毒(White Spot Syndromic Virus, WSSV)是一种致病力极强的双链DNA病毒,可以感染大部分虾蟹,感染后会出现白色斑点,死亡率极高,带来巨大经济损失。本实验室前期研究表明,WSSV感染对虾后,对虾的miRNA表达谱发生了明显改变,对虾编码的miR-1000可能参与对虾抗病毒免疫。因此,本论文进一步探索对虾miR-1000的抗病毒机理。研究发现,WSSV感染对虾后,对虾miR-1000表达显著上调,说明其与对虾抗病毒有关。在High Five昆虫细胞中进行试验,结果显示对虾miR-1000与其靶基因即病毒早期基因wsv191和wsv407直接互作。对虾体内试验表明,对虾血淋巴细胞中miR-1000过表达后,2个靶基因表达量明显下调：当敲低miR-1000表达时,wsv191和wsv407表达量显著上调。昆虫细胞试验和对虾体内试验表明,miR-1000可调控靶基因wsv191和wsv407的表达。在对虾体内,miR-1000过表达后,WSSV拷贝数和病毒感染对虾的死亡率与对照组相比都明显下降。利用反义核酸敲低miR-1000表达后,WSSV拷贝数和对虾死亡率与对照组相比显著上升。研究发现,病毒早期基因wsv191和wsv407在WSSV复制过程中起重要作用,wsv191和wsv407的下调表达会降低WSSV拷贝数和对虾死亡率。这些结果说明,对虾编码的miR-1000在病毒感染中可通过作用于病毒早期基因wsv191和wsv407来发挥抗病毒作用。为了探究宿主miR-1000是否同时调控这两个靶基因的表达,分别从miR-1000介导靶基因mRNA降解的体外试验和miR-1000与靶基因mRNA细胞内共定位两方面研究。利用凝胶迁移阻滞技术,研究发现miR-1000在Ago复合体中能同时作用于wsv191和wsv407。利用荧光原位杂交技术,发现miR-1000和靶基因wsv191以及wsv407在对虾血淋巴细胞中共定位。因此,本研究揭示了动物miRNA可同时调控两个靶基因表达。自噬在真核生物中广泛存在,将细胞内变性、损伤或衰老的蛋白质和细胞器运输到溶酶体中进行降解,为细胞正常生命活动提供能量。正常细胞中自噬活性通常比较低,而肿瘤发生发展的阶段以及肿瘤的类型都会影响自噬的活性。一方面,自噬能有效防止代谢废物对细胞及基因组的损伤,发挥抑癌作用。另一方面,自噬可为肿瘤细胞提供各种能量物质,有助于肿瘤细胞在低氧和低营养的情况下存活。研究表明,肿瘤细胞中miRNA可以调控许多自噬相关基因,miRNA的表达或缺失都会引起自噬水平的改变,从而影响肿瘤细胞的生长。本实验室已有研究发现,对虾miR-71通过抑制亲环素基因表达,诱导细胞自噬,在病毒感染中促进病毒复制。由于miR-71在不同物种中十分保守,我们猜测在胃癌细胞中miR-71可能调控细胞自噬,因此对这一问题进行了研究。研究发现,不同胃癌细胞中miR-71表达量都要比胃永生化细胞GES中的表达量高,miR-71过表达能增强胃癌细胞自噬水平,miR-71敲低则减弱自噬水平,说明miR-71能够影响胃癌细胞自噬水平的变化。miR-71可以靶向3条与自噬有关的靶基因即G3BP1、MTMR4和PAK2,在High Five昆虫细胞中,miR-71可与这3条靶基因直接互作；胃癌细胞中的试验表明,miR-71过表达使靶基因表达量下调,敲低miR-71表达则使靶基因表达量上调。研究还发现,G3BP1、MTMR4和PAK2在胃癌细胞中能够抑制细胞自噬。这些结果说明,miR-71可通过作用于G3BP1、MTMR4和PAK2来影响胃癌细胞自噬活性。为了探究miR-71是否同时调控3个靶基因的表达,一方面利用凝胶迁移阻滞技术研究miR-71介导靶基因mRNA的降解,另一方面进行miR-71与靶基因mRNA细胞内共定位分析。结果发现,miR-71在Ago复合体中可同时作用于3个靶基因,miR-71和靶基因G3BP1、MTMR4以及PAK2在胃癌细胞中共定位。因此,本研究揭示了miR-71通过同时作用于3个与自噬有关的靶基因(G3BP1、MTMR4和PAK2)促进胃癌细胞自噬。