大肠埃希菌是目前社区获得性及院内感染的主要病原菌之一,在实验室检测过程中,有着较高的分离率。从临床上看,其临床感染类型多样,感染部位不一。对其所致感染治疗效果如何,直接影响到患者的预后及病程。基于此点,各地针对大肠埃希菌的研究逐步成为感染领域的一个热点。而针对其耐药机制的研究,则是焦点所在。基于广谱抗菌药物,尤其是三代头孢菌素的滥用及不合理应用,多重耐药大肠埃希菌不断涌现。临床分离菌株除了对β-内酰胺类药物耐药外,往往伴随有氨基糖甙类、喹诺酮类抗菌药物协同耐药。究其耐药机制,从表型上看,多涉及泵出机制、胞膜渗透性改变、产生抗菌药物钝化酶及修饰酶等；从分子水平上看,多为细菌携带并稳定遗传和或菌株间传递多种耐药基因。研究表明,野生菌株产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases, ESBLs),携带单一或多种型别超广谱β-内酰胺酶耐药基因,是大肠埃希菌多重耐药的主要机制之一。超广谱β-内酰胺酶是β-内酰胺酶的一种,其编码基因多定位于质粒,少数存在于染色体上。此类酶可显著水解氧亚基β-内酰胺类抗菌药物,包括青霉素类、第一、二、三代头孢菌素及单环类药物。对于头霉烯、碳青霉烯类药物及酶抑制剂稳定敏感。自1983年首次报道以来,产酶菌株在世界范围内广泛流行。总的来看,其流行性有以下特点。(1)临床分离菌株所产酶型别增多,各酶型新的亚型不断出现。(2)除TEM、SHV型相对保守外,其他酶型亚型间核酸序列同源性较小。(3)各酶型多由TEM-1、2及SHV-1型酶突变而来。(4)菌株所携带酶型呈地域性分布。(5)各型及亚型酶抗药活性有所差异。河南地区自2000年刘新郑等人首次报道产超广谱β-内酰胺酶菌株以来,针对野生产酶大肠埃希菌耐药谱的报道不断增多,但对于其酶型及分布的研究涉之甚少。基于酶型地域性分布特征及各酶型问抗药活性差异,此种研究结果不能给临床抗感染治疗提供有力的实验室依据,势必造成医疗资源的浪费,加重患者的经济负担。作为人口众多,病源广泛,而经济相对落后的内陆省份,明确大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶的型别分布及各亚型耐药谱,指导临床合理有效抗感染治疗,最大程度地降低医疗费用,势在必行。为了系统地了解河南地区大肠埃希菌产ESBLs的型别分布特征,初步明确ESBLs编码基因定位以及主要流行型别抗药活性,作者采用双纸片协同试验及酶抑制剂增强试验筛选产ESBLs大肠埃希菌；采用PCR扩增及DNA测序技术检测大肠埃希菌中ESBLs流行型别及菌株分布模式；采用E-test检测携带不同质粒谱及ESBLs基因型菌株抗药活性；采用X2检验分析质粒谱、基因型与抗药活性的相关性；采用基因重组技术构建表达载体并表达；采用液体稀释法检测转化子抗药活性。通过上述实验,最终可为临床抗感染治疗提供可靠的实验室资料。本课题包括以下三个部分。第一部分大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶流行病学研究方法1.采用双纸片协同试验及酶抑制剂增强试验,对临床分离多重耐药大肠埃希菌进行产ESBLs筛选与确证。2.依据各型别ESBLs核苷酸同源性特征,采用DNAstar分析软件,完成特异性引物设计。3.采用PCR技术,对已确证138株产酶大肠埃希菌进行各型别ESBLs检测。4.采用DNA序列分析,明确河南地区产酶大肠埃希菌携带主要ESBLs型别。结果1.阿莫西林表现耐药,阿莫西林／克拉维酸表现敏感,两者交界处有协同现象,抑菌环直径明显扩大,产ESBLs菌株筛选试验阳性。2.头孢他啶抑菌环直径为8mm,头孢他啶／克拉维酸抑菌环直径为26mm,两者之差显著大于5mm,表明酶抑制剂增强试验阳性,产ESBLs菌株确证试验阳性。3.琼脂糖凝胶电泳显示,PCR扩增阳性产物大小以及型间差异与设计结果相一致。4.DNA序列分析结果显示,河南地区产酶大肠埃希菌中主要携带ESBLs型别为TEM-1、SHV-12、CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-25、CTX-M-38、OXA-1、OXA-20。5.138株大肠埃希菌中,TEM-1型广谱β-内酰胺酶最为流行(80.4%),然后依次为SHV-12(60.9%)、CTX-M-14(58.7%)、CTX-M-1(32.6%)、CTX-M-25 (6.5%)、OXA-1(6.5%)、CTX-M-38(4.3%)以及OXA-20(2.0%)。6.138株产酶大肠埃希菌中,单菌株可同时携带1-5种型别ESBLs,其中以携带两种型别为主(32.6%),然后依次为三种型别(26.1%)、单一型别(21.7%)、四种型别(17.4%)以及五种型别(2.2%)。7.单一型别ESBLs模式菌株,以携带TEM-1型最多见(13.0%),其次为CTX-M-14(4.3%)、SHV-12(2.2%)以及CTX-M-1(2.2%)。8.两种型别ESBLs模式菌株,以同时携带SHV-12+CTX-M-14为主(10.9%),然后依次为TEM-1+CTX-M-14(8.7%)、SHV-12+TEM-1(6.5%)、TEM-1+ CTX-M-1(2.2%)、TEM-1+CTX-M-38(2.2%)及OXA-1+CTX-M-1(2.2%).9.三种型别ESBLs模式菌株,以同时携带SHV-12+TEM-1+CTX-M-1为主(10.9%),其次为SHV-12+TEM-1+CTX-M-14(8.7%)、TEM-1+CTX-M-14+ CTX-M-38 (2.2%)、SHV-12+OXA-1+CTX-M-14 (2.2%)及SHV-12+OXA-20+CTX-M-14 (2.2%).10.四种型别ESBLs模式菌株,以同时携带SHV-12+TEM-1+CTX-M-1+ CTX-M-14为主(8.7%),其次为SHV-12+TEM-1+CTX-M-14+OXA-1(4.3%)、SHV-12+TEM-1+CTX-M-14+CTX-M-25 (2.2%)及SHV-12+TEM-1+CTX-M-1+CTX-M-25 (2.2%).11.五种型别ESBLs模式菌株,仅同时携带SHV-12+TEM-1+CTX-M-14+ CTX-M-25+CTX-M-1五种型别(2.2%)第二部分产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌质粒谱、携带超广谱β-内酰胺酶型别及其耐药性相关性研究方法1.采用分子生物学技术,检测138株产ESBLs大肠埃希菌各菌株质粒谱。2.采用PCR及DNA序列分析,明确各菌株ESBLs基因型别分布模式。3.采用E-test法药敏试验,检测不同质粒分布模式菌株针对常用抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)。4.采用E-test法药敏试验,检测ESBLs基因型别分布模式菌株MIC。5.统计学处理：所有数据均通过SPSS10.0统计学软件分析处理。质粒谱与抗药活性、质粒谱与基因型、基因型与抗药活性之间均采用X2检验分析,显著性水准α=0.05.结果1.产ESBLs大肠埃希菌可携带1～5种质粒。各质粒分子量依次为21kb、9.0kb、7.0kb、3.Okb以及2.5kb。2.138株产ESBLs大肠埃希菌有5种质粒谱模式。其中21kb质粒为各菌株均携带质粒。携带两种质粒(21kb+2.5kb)最多见(50株),其次为单一质粒(21kb,27株)、五种质粒(22株)、四种质粒(无9.0kb质粒,21株)以及三种质粒(21kb+3.0kb+2.5kb,18株)。3.不同质粒条带的各菌株具有以下特点：均对青霉素类、头孢一、二代及三代中头孢噻肟、头孢曲松耐药。对头孢他啶表现为体外试验敏感。对亚胺培南以及阿米卡星稳定敏感。各菌株对头孢毗肟的耐药性不一4.不同质粒条带菌株间MIC结果统计学分析后,X2值为0.00/0.21,p值均>0.5/0.9,组间耐药性无显著性差异,表明各菌株耐药性与质粒条带数相关性不强。5.质粒条带数与相应菌株携带ESBLs型别之间X2值为29.39,p>0.05,表明组间无显著性差异,提示两者无显著相关性。6.不同型别ESBLs菌株及其对不同抗菌药物MIC值之间X2为0.00/0.21,p值均>0.5/0.9,表明组间无显著性差异,提示各菌株耐药性与所携带ESBLs型别分布相关性不强。第三部分大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶主要酶型抗药活性研究方法1.采用分子生物学技术,分别构建pET-28a-TEM-1、pET-28a-SHV-12以及pET-28a-CTX-M-14表达载体。2.采用氯化钙转化技术,制备转化子BL21-TEM-1、BL21-CTX-M-14以及JM109-SHV-12。3.采用液体稀释法体外药物敏感试验,分别检测宿主菌BL21、JM109及转化子BL21-TEM-1、BL21-CTX-M-14、JM109-SHV-12抗药活性。结果1.以转化子携带质粒为模板进行PCR扩增,约900bp位置处有目的条带,提示重组质粒构建成功。2.BL21、JM109大肠杆菌对于各种类型抗菌药物均表现敏感。3.产TEM-1转化子对于青霉素类药物显著耐药,氨苄西林、派拉西林MIC均大于32μg/ml。对部分头孢一代抗菌药物有水解作用,头孢唑啉MIC大于16μg/ml。对于头孢三代、四代抗菌药物显著敏感,头孢噻肟、头孢他啶MIC均小于1μg/ml。β-内酰胺酶酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦及他唑巴坦可明显抑制TEM-1水解活性,从而降低菌株耐药性,阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦及派拉西林/他唑巴坦MIC均小于8/4μg/ml。碳青霉烯类及单环类抗菌药物稳定敏感,亚胺培南MIC小于4μg/ml,氨曲南MIC小于16μg/ml。4.产SHV-12转化子对于青霉素类具有广泛水解活性,氨苄西林及哌拉西林MIC均大于16μg/ml。对头孢一代、三代抗菌药物表现为耐药,头孢唑林与头孢噻肟MIC均大于16μg/ml,而头孢他啶MIC大于32μg/ml。β-内酰胺酶抑制剂可降低该酶的抗药活性,含酶抑制剂药物均表现为敏感。氨曲南MIC等于16μg/ml,表现为中度敏感,考虑转化子表达酶量或产物活性改变所致。碳青霉烯类抗菌药物稳定敏感,亚胺培南MIC小于4μg/ml。5.产CTX-M-14转化子对氨苄西林、派拉西林显著耐药(MIC>32μg/ml及64μg/ml),对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢吡肟、头孢克洛MIC值均>16μg/ml,而头孢曲松则>32μg/ml,均表现为显著耐药。同时,该型酶对头孢塞肟及头孢他啶的的水解能力相差32倍以上,MIC分别为>32μg/ml及≤1μg/ml,前者耐药,后者表现为敏感。另,CTX-M-14对于氨曲南稳定耐药(MIC)16μg/ml),而对于亚胺培南稳定敏感(MIC≤4μg/ml)。对于加酶抑制剂的抗菌药物稳定敏感(阿莫西林／棒酸、氨苄西林／舒巴坦、派拉西林／他唑巴坦及头孢哌酮／舒巴坦)。此外,该型ESBL对于喹诺酮、四环素类药物多敏感。结论1.河南地区大肠埃希菌产ESBLs有TEM-1、SHV-12、CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-25、CTX-M-38、OXA-1、OXA-20等型别存在,其中主要流行型别为TEM-1、SHV-12以及CTX-M-14;同一菌株可具有1-5种ESBLs基因型别模式,其中以两种型别最为多见。2.菌株携带质粒谱与其耐药活性无显著相关性；菌株携带质粒谱与其携带ESBL型别无显著相关性；菌株携带ESBL型别与其耐药活性无显著相关性。3. BL21-TEM-1表达产物属于广谱β-内酰胺酶,转化子主要对青霉素类耐药,β-内酰胺酶抑制剂可抑制酶活性。BL21-CTX-M-14、JM109-SHV-12表达产物属于超广谱β-内酰胺酶,转化子对青霉素类、头孢菌素类抗菌药物均显著耐药,β-内酰胺酶抑制剂可抑制酶活性。