结直肠癌(colorectal cancer,CRC)属于全球最常见的恶性肿瘤,每年有超过一百万新诊断的病例。在我国结直肠癌发病率及死亡率均在第5位,且统计分析显示在男性和女性中结直肠癌的发病率均持续增高。结直肠癌由多种因素引起,例如结肠直肠腺瘤、肠道炎症和肠道菌群疾病等。该疾病发生发展涉及多种机制,最重要的是过度增殖、凋亡调节的丧失、侵袭性表型的获得、血管生成的增加和结直肠癌干细胞(colorectal cancer stem cells,CSC)的维持。这种发生进展通常涉及许多致癌基因的上调,以及重要肿瘤抑制基因的下调。在众多基因中,微小RNA(microRNA,miRNA)日益受到研究者及临床医生的关注,成为研究的热点。miRNA为长约19～22nt的非编码RNA。可以与特定的mRNA结合,在转录后水平负调节基因表达。越来越多的证据表明miRNA可控制多种生物学过程,是机体生长发育和细胞稳态的关键调节因子。miRNA调节靶mRNA并对蛋白质输出进行精细调整。因此,miRNA功能的失调可导致多种人类疾病,如阿尔茨海默病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、和头颈癌,也包括结直肠癌。miRNA是进化上保守的分子,可通过影响癌症干细胞生物学、血管生成、上皮-间充质和间充质-上皮细胞转变或耐药性参与各种生理和病理过程,包括CRC转移。miRNA表达的异常可导致CRC的发生发展。这种效应可能通过miRNA基因座的缺失、扩增或点突变、表观遗传沉默、转录因子的失调(miRNA表达的修饰因子)或抑制初级miRNA加工成其成熟形式而得到强化。当上调时,某些特定的miRNA可以抑制负责生长/增殖的基因,并且其他特定miRNA的下调可以增强负责促进生长/增殖的基因的表达,从而导致癌症的发展或进展。因此,鉴定miRNA靶标及其功能调节网络对于理解miRNA的正常生物学过程及其在疾病发生发展中的作用至关重要。目前为止,miRNA在CRC中的表达、功能及机制仍不完全明确,尚需进一步深入研究。上皮细胞-间质转化(epithelial cell mesenchymal transition,EMT)是一种复杂的细胞过程,在此过程中上皮细胞获得间充质表型。EMT与肿瘤的侵袭性或转移性表型相关。越来越多的研究为EMT在包括CRC在内的多种恶性肿瘤的癌症进展和转移中发挥的重要作用提供了有力的证据。在CRC中,认为EMT有利于增加侵袭前沿中肿瘤细胞的运动性并增加肿瘤对细胞凋亡的抗性,是导致癌症转移的重要机制。ZEB1(锌指E盒结合同源框1)是一种著名的癌基因,可以促进各种恶性肿瘤的迁移和上皮-间质转化,包括结直肠癌。已发现一些调节EMT的miRNA仅与一种ZEB转录因子相互作用。例如,在膀胱癌中,miR-23b的表达用于区分正常组织和膀胱癌组织,并且该miR-23b的高表达与膀胱癌患者的高总体存活率正相关。在CRC中,miR-147与EMT基因表达特征评分高度负相关,并假定为反向EMT(MET)。最近的一项研究表明,ZEB1在结直肠肿瘤的侵袭区域和肿瘤-基质界面中被检测到:显示极性成分减少的区域。ZEB1通过抑制上皮BM成分层粘连蛋白α-3(LAMA3)的表达来诱导基底膜(BM)的丧失。它与LAMA3启动子上的Z1、Z2和E2特异性结合并抑制转录活性。ZEB1沉默上调结直肠癌细胞中几种极性基因的表达,包括CRB3和LGL2。LGL2启动子是ZEB1的直接靶标,LGL2的丢失与CRC中EMT和转移增加有关。miR-873-5p是miRNA家族中的一员,其首先在癫痫大鼠的记忆受损的颞叶海马中被发现。在阿尔兹海默病患者中,miR-873-5p靶向HMOX1以调节其表达进而抑制神经元细胞的凋亡而发挥保护性作用。在粘连蛋白诱导的肾损伤中,METTL3/m6A/miRNA-873-5p通过调节Keap1/Nrf2通路减轻氧化应激和细胞凋亡发挥肾保护作用。在肺癌中,miR-873-5p作为LncRNADCGR5的下游靶基因调控TUSC3的表达,从而在肿瘤进展中发挥重要作用。miR-873-5p在胃癌中低表达,而Gli1的表达显著增强。miR-873-5P的过表达降低细胞活力,增加细胞凋亡和细胞周期停滞。同时,敲除Gli1明显诱导SGC-7901细胞凋亡和细胞周期停滞。双荧光素酶报告基因测定显示Gli1是miR-873-5p的靶基因。更重要的是,即使在转染si-Gli1的细胞中,miR-873-5p的抑制也明显降低了 CyclinB1和Bc12的蛋白表达。总之,miR-873-5p主要通过靶向Gli1在胃癌中起抑癌基因的作用。鉴于miRNA在CRC细胞活动中的作用,对CRC相关miRNA的功能及其与肿瘤发生发展的关系的研究,为CRC的精准治疗提供新的靶点,可能会有助于改善预后。目前尚无miR-873-5p在结直肠癌中的表达及其相关生物学功能的报道。本课题拟研究miR-873-5p在CRC中的表达情况、生物学功能以及可能的机制。第一部分miR-873-5p在结直肠癌中的表达及其生物学功能目的:旨在研究miR-873-5p在结直肠癌组织、结直肠癌细胞系中的表达情况,以及其可能的生物学功能。方法:qRT-PCR检测正常人结肠上皮、幼年性息肉、溃疡性结肠炎、结直肠腺瘤及结直肠癌、癌旁组织以及正常肠上皮细胞系与结直肠癌细胞系中miR-873-5p的表达情况。构建利用miR-873-5p mimics及Inhibitors转染不同CRC细胞系以过表达或沉默miR-873-5p的表达以行后续功能试验,qRT-PCR检测转染效果。转染后,利用Transwell行细胞侵袭及细胞迁移实验检测miR-873-5p对细胞侵袭与迁移的影响。结果:1.qRT-PCR结果示:在幼年性息肉、结直肠癌旁组织、溃疡性结肠炎、结直肠腺瘤及结直肠癌组织中的表达较正常肠上皮组织降低,结直肠癌组织与正常肠上皮组织比较差异具有统计学意义。与HIEC正常人肠上皮细胞系相比,CRC细胞中miR-873-5p的水平更低,差异具有统计学意义。2.利用miR-873-5p mimics及Inhibitors转染不同CRC细胞系以过表达或沉默miR-873-5p的表达。使用qRT-PCR检测转染后miR-873-5p的表达,在HCT-116细胞中转染miR-873-5p mimics后miR-873-5p表达水平明显升高,而在SW-480细胞中转染miR-873-5p Inhibitors后,miR-873-5p表达水平明显降低。3.在HCT-116细胞中转染miR-873-5p mimics过表达miR-873-5p后,显著抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭。4.在 SW-480 细胞中转染 miR-873-5p Inhibitors 敲除 miR-873-5p 的表达(anti-miR-873-5p)可显著促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭。小结:miR-873-5p在CRC组织及细胞中下调且抑制CRC细胞的增殖、迁移与侵袭,发挥抑癌因子的作用。第二部分miR-873-5p介导EMT调节CRC细胞迁移与侵袭目的:进一步研究miR-873-5p在结直肠癌细胞迁移与侵袭中的可能机制。方法:构建利用miR-873-5p mimics及Inhibitors转染不同CRC细胞系以过表达或沉默miR-873-5p的表达以行后续功能试验。Western blot和免疫荧光染色确定EMT相关标记物的表达情况。结果:1.在HCT-116中过表达miR-873-5p后上皮细胞标记物E-cadherin、β-catenin和ZO-1水平明显升高,而间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin的水平显著降低。同时细胞形态由间质细胞向上皮细胞转化。2.在SW-480细胞系中敲除miR-873-5p后上皮细胞标记物E-cadherin、β-catenin和ZO-1水平明显减少,而间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin的水平显著升高。小结:miR-873-5p通过调控EMT调节CRC细胞迁移与侵袭。第三部分miR-873-5p下游靶基因鉴定目的:探索miR-873-5p可能的下游靶基因并验证。方法:利用生物信息学方法(miRanda和TargetScan)推测miR-873-5p可能的作用靶点,取其交集,筛选出被miR-873-5p负性调节的基因,进一步筛选出与EMT、细胞迁移侵袭相关的基因,预测其可能的作用靶点。然后通过分子生物学实验(双荧光素酶报告基因、拉下实验、补救实验等)鉴定其可能的作用机制。结果:1.通过使用两种生物信息学预测工具(TargetScan和miRanda)预测miR-873-5p的靶基因,取其交集,共计77种潜在靶mRNA,77种mRNA中的13种被miR-873-5p负调节。在这13种mRNA中,ZEB1与细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)密切相关。通过使用公共生物信息学工具TargetScan获得miR-873-5p与ZEB1之间的推定结合序列。2.ZEB1在CRC组织和细胞系中高表达。3.双荧光素酶报告基因示在HCT-116细胞系中,miR-873-5p过表达显著降低ZEB1的野生型3’UTR(ZEB1-WT)的荧光素酶活性,但不显著降低ZEB1的突变型3’UTR(ZEB1-MUT)的荧光素酶活性。在SW-480细胞中,miR-873-5p表达的抑制有效地增强了 ZEB1-WT的野生型3’UTR的荧光素酶活性,但没有提高ZEB1-MUT的突变型3,UTR的荧光素酶活性,数据表明ZEB1表达受miR-873-5p负调节。4.拉下试验分析显示ZEB1 可以被Bio-miR-873-5p而不是Bio-miR-873-5p-MUT 或 Bio-NC 拉下。Western blot 证实 ZEB1 与 Bio-miR-873-5p负相关。证实ZEB1是miR-873-5p的下游结合靶点。5.在 HCT-116 转染 miR-873-5p mimics 过表达 miR-873-5p 后 ZEB1 在 mRNA及蛋白质水平均表达降低,同时在SW-480转染miR-873-5p inhibitors低表达miR-873-5p后ZEB1在mRNA及蛋白质水平均表达增加。6.补救试验证实ZEB1的过表达部分逆转了 miR-873-5p对HCT-116细胞的迁移和侵袭能力的抑制作用。此外,ZEB1的过表达减弱了 miR-873-5p对HCT-116细胞的EMT的逆转作用。同时,敲低ZEB1逆转了 anti-miR-873-5p介导的SW-480细胞的迁移,侵袭和EMT。小结:ZEB1是miR-873-5p的下游结合靶点,受miR-873-5p负性调节。结论通过qRT-PCR我们首次发现miR-873-5p在CRC组织及细胞中低表达。行功能实验证实miR-873-5p抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭。miR-873-5p可能通过介导EMT生物过程影响细胞增殖、迁移和侵袭。通过生物信息学分析,荧光素酶报告基因和拉下实验,我们证实,ZEB1是miR-873-5p的下游靶基因,且受miR-873-5p的负性调节。补救实验证明了 miR-873-5p-ZEB1轴对结直肠癌细胞的迁移、侵袭和EMT过程的影响。总之,我们证实miR-873-5p通过靶向ZEB1抑制结直肠癌中的细胞迁移、侵袭和EMT。