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性别是生命科学的重大命题之一,性别决定及其调控机制一直是遗传学、发育生物学和进化生物学的前沿和热点科学问题之一。脊椎动物中发现有遗传型(genetic sex determination:GSD)和环境型(environmental sex determination:ESD)两种性别决定方式。Dmrt1是Dmrt家族的一员,被认为是第一个参与无脊椎动物向人类性别分化的保守基因,是精巢形成及发育重要的调控因子。相对于遗传型的广泛研究,环境型物种的性别调控方式还并不是十分清楚。因黄喉拟水龟等龟鳖类动物在物种进化过程中处于承上启下的位置,具有丰富的调控方式,关于龟鳖类性别调控的研究也一直备受关注。因此,在具有温度依赖型性别决定的黄喉拟水龟中进行性别调控相关基因表达模式的研究对于揭示环境性别决定机制具有重要意义。本论文以黄喉拟水龟Dmrt1基因为研究对象,对其性别决定机制进行研究,本研究具体内容如下:1.黄喉拟水龟Dmrt1基因的克隆及分析本研究通过黄喉拟水龟雌雄性腺转录组数据筛选和克隆Dmrt1cDNA全长序列,RACE-PCR结果显示该序列共1811 bp,包括3’端非编码区572 bp,5’端有129 bp,其中基因结构正常的核苷酸序列(ORF区域)共1110 bp,包含370个氨基酸。氨基酸序列多重比对显示,黄喉拟水龟Dmrt1与红耳龟(Trachemys scripta)同源性最高,达97.57%;与中华鳖(Pelodiscus sinensis)Dmrt1同源性达75.54%。与小鼠(Mus musculus)Dmrt1同源性达63.25%,与中华鲟(Acipenser sinensis)Dmrt1同源性最低,为21.62%。系统进化树分析表明,黄喉拟水龟与草龟、红耳龟、西部锦龟亲缘关系最近,聚为一个小的分支。2.黄喉拟水龟Dmrt1基因的组织特异性表达定量结果显示,雌雄黄喉拟水龟Dmrt1在心、肝、脾、肾、眼、脑、肌肉等组织中表达量极低,在雌性性腺中表达量较少,在睾丸中呈现高度表达状态。3.黄喉拟水龟Dmrt1在雄性性腺中的表达分布情况原位杂交分析显示,黄喉拟水龟Dmrt1mRNA在精巢中表达。其中黄喉拟水龟Dmrt1的表达主要集中在支持细胞中,在精原细胞中有少量信号,而在精细胞和精子中几乎不信号。4.黄喉拟水龟Dmrt1基因胚胎发育各时期的特异性表达分析结果显示,在产雄温度(25℃)以及从32℃转25℃条件下孵育的黄喉拟水龟的Dmrt1基因在性腺分化启动前第16期其雄性特异性表达就已开始。Dmrt1在25℃产雄温度下胚胎发育的19期-22期表达量逐步增加且显著高于32℃产雌温度下表达量。以上研究表明,Dmrt1基因可能参与黄喉拟水龟性别决定和雄性性腺分化过程,参与雄性性腺的发育过程,本研究为进一步揭示黄喉拟水龟温度依赖型性别调控机制奠定了基础。