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铁是机体许多代谢活动的必需元素,参与了氧的转运和利用以及生命活动相关的多种酶的组成,在能量代谢、DNA合成以及调控细胞周期进程的因子等方面均有重要作用。研究表明,绝大多数细胞包括肿瘤细胞摄取铁主要通过转铁蛋白受体（transferrin receptor,TfR）介导。由于TfR在过度增殖细胞中高表达,特别是恶性血液肿瘤细胞,因此TfR表达的调节对肿瘤细胞的增殖分化及对肿瘤诊治有重要影响。青蒿素（artemisinin）是我国科学家在1971年首次从菊科植物黄花蒿（Artemisia annua Linn）中提出的具有新型结构的倍半萜内酯,具有高效低毒的抗疟作用。近年来研究发现,青蒿素类药物具有较好的体内外抗肿瘤活性,二氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）为青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物,与其他青蒿素类药物相比显示出更强的抗肿瘤活性。近年来大量研究也表明,青蒿素类药物发挥细胞毒作用所表现的抗肿瘤活性与Fe2+的参与密切相关。本课题组的前期研究表明二氢青蒿素可有效抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,并能抑制慢性髓性白血病K562细胞和早幼粒急性髓性白血病HL60细胞增殖。而对于二氢青蒿素能否显著下调富铁白血病细胞TfR和VEGF表达,并进一步增强对富铁白血病细胞增殖的抑制作用,目前尚未见报道。本文选取TfR和VEGF高表达的粒系白血病细胞株HL60和K562为研究对象,通过建立常铁HL60和K562细胞以及富铁K562细胞体外培养模型,以TfR和VEGF为靶标,从细胞分子水平研究二氢青蒿素增强对富铁K562细胞增殖抑制的可能机制,为青蒿素类药物有可能作为一种特异的、毒性小而有效的白血病（辅助）治疗药物提供药理学依据。结果:1.二氢青蒿素下调粒系白血病细胞TfR的密度实验结果表明,二氢青蒿素能显著降低HL60细胞和K562细胞TfR的密度,且呈浓度依赖性。二氢青蒿素0.5,1μM组显示,HL60细胞TfR的密度相对于溶剂对照组分别下降了12.0%,33.2%（P＜0.05）。二氢青蒿素5,10μM组显示,K562细胞TfR的密度相对于溶剂对照组分别下降了31.6%,48.5%（P＜0.05）。而在富铁培养条件,即细胞经过Holotransferrin预处理1h后,再给予10μM二氢青蒿素,对K562细胞TfR密度的下降作用更强。与常铁培养组比较,相同浓度二氢青蒿素对富铁K562细胞TfR的密度下降了30.2%（P＜0.05）。2.二氢青蒿素下调粒系白血病细胞TfR的表达Western blotting实验表明,二氢青蒿素能显著下调HL60细胞和K562细胞TfR蛋白的表达,且呈浓度和作用时间依赖性。HL60细胞经不同浓度二氢青蒿素（0.25,0.5和1μM）作用48h后,随着药物浓度的增加,TfR蛋白的表达量递减,与溶剂对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。HL60细胞经1μM二氢青蒿素作用12h,24h,48h后,TfR蛋白的表达呈时间依赖性地减弱,相对于溶剂对照组有显著性差异（P＜0.05）。K562细胞经10μM二氢青蒿素作用12h,24h,48h后,TfR蛋白的表达量相对于溶剂对照组分别下调了30.6%,48.1%,58.2%（P＜0.05）。10μM二氢青蒿素能显著下调常铁培养的K562细胞TfR蛋白的表达,而二氢青蒿素对富铁K562细胞TfR蛋白表达的下调作用更强。与常铁培养组比较,相同浓度二氢青蒿素对富铁K562细胞TfR蛋白表达量下调了28.1%,统计学上有显著性差异（P＜0.01）。RT-PCR结果显示,10μM二氢青蒿素能显著抑制TfR mRNA的表达,而二氢青蒿素对富铁K562细胞TfR mRNA表达的抑制作用更强。与常铁培养组比较,相同浓度二氢青蒿素对富铁K562细胞TfR mRNA表达量下调了26.2%（P＜0.05）。3.二氢青蒿素下降粒系白血病K562细胞铁的含量原子分光光度法结果表明,二氢青蒿素能显著下降K562细胞铁的含量,且呈浓度依赖性（P＜0.05）。10μM二氢青蒿素能显著减少常铁培养的K562细胞铁的含量,而二氢青蒿素对富铁K562细胞铁含量的下降作用更强。与常铁培养组比较,相同浓度二氢青蒿素对富铁K562细胞铁含量下降了28.8%（P＜0.05）。4二氢青蒿素抑制富铁K562细胞VEGF的表达及其诱导的血管新生RT-PCR结果显示,10μM二氢青蒿素能显著抑制VEGF mRNA的表达,而二氢青蒿素对富铁K562细胞VEGF mRNA表达的抑制作用更强。与常铁培养组比较,相同浓度二氢青蒿素对富铁K562细胞VEGF mRNA表达量下调了16.4%（P＞0.05）。Western blotting结果显示,10μM二氢青蒿素能显著下调常铁培养的K562细胞VEGF蛋白的表达,而二氢青蒿素对富铁K562细胞VEGF蛋白表达的下调作用更强。与常铁培养组比较,相同浓度二氢青蒿素对富铁K562细胞VEGF蛋白表达量下调了36.3%（P＜0.01）。ELISA结果显示,5μM二氢青蒿素即能显著下调常铁培养的K562细胞条件培养基（CM）中VEGF蛋白的分泌,而二氢青蒿素对富铁K562细胞CM中VEGF蛋白分泌的下调作用更强。与常铁培养组比较,10μM二氢青蒿素对富铁K562细胞CM中VEGF蛋白分泌量下调了68.7%（P＜0.001）。CAM实验表明,与DMSO溶剂组相比,2.5,5和10μM二氢青蒿素预处理细胞的CM,对CAM血管新生的促进能力分别下降了28.2,44.2 and 56.7%;而经二氢青蒿素预处理的富铁K562细胞CM,对CAM血管生成的促进能力更显著降低,其中经10μM二氢青蒿素预处理的富铁K562细胞CM,其促CAM血管生成的能力相比于经相同浓度二氢青蒿素预处理的富铁K562细胞CM下降了23.8%（P＜0.05）。5二氢青蒿素抑制粒系白血病细胞增殖实验结果表明,二氢青蒿素能有效抑制HL60细胞和K562细胞的增殖,且呈浓度和作用时间依赖性。经二氢青蒿素作用48 h后,对HL60细胞的IC50值为1.74μM,95%置信区间分别为0.86-2.60μM,对K562细胞的IC50值为11.33μM,95%置信区间为9.38-13.68μM。Holotransferrin对K562细胞增殖具有促进作用,在Holotransferrin作用浓度20nM时增殖能力达到峰值。经量效分析,经Holotransferrin预处理使细胞呈富铁状态,1h后再加入不同浓度的二氢青蒿素,对K562细胞抑制作用明显增强,其IC50值为3.67μM,是对常铁K562细胞抑制作用的3.1倍。经时效分析,10μM二氢青蒿素作用富铁K562细胞36 h后,存活的细胞数为常铁培养组的38.9%,作用48 h后降为25.0%。6 TfR与VEGF表达的相关性分析综合以上实验结果分析,在常铁和富铁K562细胞中,高表达的TfR蛋白与VEGF蛋白表达成正相关（r=0.902,P＜0.01）;在RT-PCR实验中也得到了一致的结果（r=0.671,P＜0.05）。此外,ELISA实验也表明,TfR表达与VEGF蛋白分泌之间存在着显著的相关性（r=0.846,P＜0.01）;而TfR蛋白与mRNA表达与K562细胞诱导的血管生成也成正相关（r=0.916,P＜0.01;r=0.860,P＜0.01）。以上研究结果表明:（1）二氢青蒿素能显著的降低K562细胞铁的含量,能更有效的抑制富铁K562细胞的增殖;（2）二氢青蒿素能更显著下调富铁粒系白血病K562细胞TfR密度和TfR蛋白、mRNA的表达;（3）二氢青蒿素能更显著下调富铁粒系白血病K562细胞VEGF蛋白的表达和分泌,表现出更有力地抑制其诱导的血管新生。结论:通过下调粒系自血病细胞转铁蛋白受体表达及抑制VEGF自分泌/旁分泌作用,二氢青蒿素可以更显著降低富铁细胞的铁含量及抑制细胞增殖。