本论文以一株表达猪α-干扰素(pIFN-α)的甲醇营养型重组毕赤酵母作为研究对象,从提升pIFN-α表达水平入手,综合运用人工智能技术、在线检测技术、多变量聚类分析、代谢酶学分析等方法,在5 L和10 L规模发酵罐条件下,开展了毕赤酵母高密度流加培养高效表达pIFN-α过程的优化和控制、故障诊断及代谢调控研究。论文主要研究结果如下:(1)将本研究室前人所提出的、基于DO/pH在线测量和人工神经网络模式识别模型的控制系统(artificial neural network pattern recognition based control, ANNPR-Ctrl)应用于两株分别表达pIFN-α和植酸酶的重组毕赤酵母高密度流加培养过程中,并对该控制系统的有效性和通用性进行了验证。研究结果表明,在细胞生长阶段,使用ANNPR-Ctrl控制系统不仅能将流加培养过程中的底物(甘油或葡萄糖)浓度控制在较低水平,而且细胞比增殖速度明显高于传统DO-Stat法,与DO-Stat法相比,相同培养时间内两种重组毕赤酵母的细胞浓度分别提高81%和44%。该控制系统为实现毕赤酵母高密度培养搭建了一个通用平台。(2)利用甲醇电极在线控制甲醇浓度,同时对反映细胞代谢活性的多个状态变量进行同步监测,实时在线地寻找适合pIFN-α表达的最佳诱导条件。研究结果表明,在诱导表达阶段,高而稳定的摄氧速度(oxygen uptake rate, OUR)的形成是实现pIFN-α高效表达的关键因素,其形成不仅需要在诱导期控制甲醇浓度于适中水平(10 g/L),同时还要对混和(甘油/甲醇)流加培养阶段的细胞比增殖速度进行适度控制,使诱导前的细胞生理功能处于正常状态。在高而稳定的OUR (200-300 mmol/L/h)条件下,pIFN-α最高活性可以达到6.6×106 IU/mL。(3)研究了低温诱导对细胞代谢活性、pIFN-α生产能力和甲醇代谢途径关键酶转录水平的影响。发现:把诱导温度从30°C降低到20°C后,1)细胞对甲醇环境的适应能力明显增强,诱导适应期缩短了近5小时;2)细胞代谢甲醇能力明显增强,不同甲醇浓度水平下的稳定醇氧化酶(AOX)活性、甲醇和氧比消耗速率均大幅提高,约为30°C诱导下的2-3倍;3) 5 L发酵罐下,最高pIFN-α抗病毒活性提高了近10倍;4)甲醇代谢途径关键酶包括解毒酶转录水平是传统30°C诱导时的1.36-16.47倍。(4)重组毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程高度耗氧。从甲醇代谢的角度分析了低温诱导下pIFN-α表达量无法持续提高的深层原因,并在此基础上提出了一种复合诱导(低温+高溶解氧浓度复合控制)策略,该策略通过解除供氧不足、提高NADH使用率和ATP的再生效率,使更多碳流用于pIFN-α蛋白的合成、pIFN-α抗病毒活性可持续提高,最高活性比单纯低温诱导和30°C标准诱导策略下明显提高,达到3.62×10~7 IU/mL。(5)发酵过程的控制和优化并不能确保发酵生产的高效和稳定。利用30°C诱导时所得到的多批次发酵数据,包括多变量在线检测数据和离线数据,提出了一种简单、直接而有效的多变量聚类分析方法和相应的故障识别/早期预警系统,并对该故障识别和预警系统的有效性进行了验证。以pIFN-α生产性能作为评价指标,将“正常”和“异常”发酵批次下诱导表达期内的多个状态变量以合理的方式组合后,在相应的2维平面图上进行聚类分析,找出“正常”发酵形成的前期条件。根据以上多变量聚类分析的结果,对“正常”和“异常”发酵批次下细胞生长期的重要生理数据进行了反向聚类分析,找出了各“正常”和“异常”发酵批次在细胞生长期内的聚类特征,从而在发酵进入到诱导期之前,即可对发酵是否异常进行预判,可以实现发酵过程的故障诊断和早期预警。(6)在前期研究的基础上,开展了中型发酵罐下毕赤酵母表达pIFN-α的放大研究。研究结果表明,在相同控制条件(甲醇浓度、温度等)下,10 L发酵罐下的pIFN-α抗病毒活性均低于5 L罐下的水平。10 L罐下,降低诱导温度或采用30°C、甲醇/山梨醇共混诱导方式均能提高pIFN-α的表达水平。进一步的代谢酶学分析表明,甲醇/山梨醇共混诱导时,甲醇代谢的能量途径发生了改变,供能途径由甲醇氧化途径转向TCA循环,有利于解除甲醇氧化途径的中间产物甲醛对细胞的毒性作用,30°C诱导下,能量体系运转正常,最高pIFN-α抗病毒活性(1.8×10~7 IU/mL)超过或接近5 L罐下、20°C诱导及复合诱导(20°C+高溶解氧浓度)时的最高水平,发酵成本下降、整体发酵性能提高。