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热休克蛋白(HSP)是一组在结构上高度保守的多肽,广泛存在于原核和真核细胞中,具有参与新生蛋白的折叠、转运、重折叠变性蛋白、协助降解变性蛋白和抗逆环境胁迫等功能。本研究通过生物信息学结合实验手段,以蓝藻和真核微藻为研究对象,对其中的热休克蛋白家族基因进行了比较和进化分析;对亚心型扁藻叶绿体基因组编码的热休克蛋白进行了比较和进化分析;对经济绿藻雨生红球藻的重要热休克蛋白基因进行了克隆和功能研究。具体结果如下:
1)通过蓝藻和真核微藻热休克蛋白数目和种类的比较发现:真核微藻中含有的热休克蛋白的种类和数量普遍高于蓝藻;在蓝藻中,丝状或固氮蓝藻中具有的热休克蛋白的种类和数量一般多于单细胞蓝藻;除了HSP20和HSP33以外,其他各类HSP在所有微藻中均普遍存在;HSP20在所有已测序的原绿球藻和硅藻、定鞭藻中均未发现,HSP33也在两种原绿球藻中缺失。
2)通过HSP各个家族的系统进化来分析研究热休克蛋白家族的起源,发现:HSP20只有一个基因型,为非蓝藻起源;HSP33和HSP101只有一个基因型,为蓝藻起源;HSP40、HSP70和HSP90均各自有蓝藻起源和非蓝藻起源两个基因型,;HSP60也分为两个基因型,一个为非蓝藻起源,另一个未知,需要更多的数据来补充。此外,在HSP进化过程中,普遍存在物种分离后基因的复制和转移现象,偶尔也存在物种特异性的基因复制。
3)采用蔗糖密度梯度离心结合CsCl密度梯度离心相结合的方法,成功提取了亚心型扁藻的叶绿体基因组,通过454GS FLX测序后,采用生物信息学分析方法对其基因内容、代谢途径和起源进化进行分析。发现亚心型扁藻的叶绿体基因组中除含叶绿体基因组特有三大类基因外,还含有抗逆基因hsp33和hsp70,这是在已测序的绿藻叶绿体基因组中首次发现的热休克蛋白基因。参与光合系统的碳固定,氧化磷酸化,光合作用,核糖体代谢和RNA聚合酶代谢五大生物学过程,进化地位符合叶绿体的一次内共生学说。
4)从经济绿藻雨生红球藻中克隆了两个重要的热休克蛋白家族成员HSP70和HSP90的全长cDNA序列,并采用实时定量PCR检测了高温低温和紫外光刺激下,二者的mRNA表达情况,结果显示,面对各种逆境刺激,两种热休克蛋白均有显著的表达,且HSP70的表达更加明显,推测HSP70较HSP90可能在藻类的抗逆中发挥更大的作用。
本研究将基础研究与实验验证相结合,首次利用比较基因组学的方法对微藻的热休克蛋白家族基因进行了全面的比较进化分析,并通过对亚心型扁藻叶绿体基因组的提取测序,对微藻叶绿体基因组编码的热休克蛋白也进行了比较和进化分析。同时也克隆了雨生红球藻的两种重要热休克蛋白基因,并对其在藻体抗逆过程中的功能进行研究。