论文部分内容阅读
本文对虎奶菇菌核多糖的提取、分离纯化方法以及理化性质等展开系统的研究，对虎奶菇菌核多糖的抗氧化活性、降血糖活性、激活免疫细胞活性等进行较为全面和深入的探讨，试验结果将促进虎奶菇多糖的的进一步开发和应用。主要研究内容和结果如下：
1．虎奶菇菌核多糖的提取工艺。分别采用热水和碱液提取虎奶菇菌核多糖。结果表明，虎奶菇菌核水提多糖(W-CHNP)适宜提取条件为：料液比1：30(W：V)、100℃、2 h，多糖的得率为1.42％。碱提多糖(A-CHNP)适宜提取条件为：料液比1：6(W：V)、0.5 mol/L NaOH、2 h，多糖的得率为0.25％。采用超声波萃取法可使W-CHNP、A-CHNP的多糖得率比热水浸提、碱液浸提法分别提高了19％和22.3％，提取时间大大缩短至20-25 min。
2．虎奶菇菌核多糖的纯化及其纯度鉴定。W-CHNP和A-CHNP经过乙醇沉淀、丙酮和乙醚脱脂、蛋白酶法结合Sevag法脱蛋白、超滤和透析、葡聚糖凝胶柱层析进行分离纯化。W-CHNP依次进行SephadexG-100和G-200的柱层析得纯化水提多糖(W-HNP)；A-CHNP依次进行Sephadex G-75和G-100的柱层析得纯化碱提多糖(A-HNP)。经多糖PAGE实验鉴定其纯度，W-HNP、A-HNP均只含分子量较大的多糖。
3．虎奶菇菌核多糖的理化特性。采用HPGPC法测定多糖的分子量，W-HNP的重均分子量和数均分子量分别为163.7 kD、129.2 kD；A-HNP 的重均分子量和数均分子量分别为305.6 kD、85.2 kD。刚果红实验表明W-HNP、A-HNP都存在三股螺旋构象。GC实验结果表明，W-HNP的单糖组分为葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸，其含量分别为44.232％、39.958％、15.81％；A-HNP的单糖组分为葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，其含量分别为27.691％、28.467％、8.820％、35.642％。
采用UV、IR、GC、<1>H NMR对虎奶菇菌核多糖 W-HNP、A-HNP的结构进行鉴定，表明两种多糖都是主要以β-型异头结构体的环形结构存在，但A-HNP的C质子信号的化学位移与W-HNP有较大的区别。二者都具有β-D-吡喃糖糖型C—H变角振动的特征吸收峰，表明W-HNP、A-HNP组成的单糖均为β-吡喃糖。
4．虎奶菇菌核多糖的抗氧化作用。虎奶菇菌核多糖W-HNP、A-HNP均具有抗氧化活性，其抗氧化活性随多糖浓度增加而增强，且A-HNP抗氧化活性比W-HNP要强。在体外，W-HNP、A-HNP对DPPH·、O<,2><->及·OH均有清除作用，能够抑制·OH对小鼠肝微粒体脂质过氧化反应和MDA的生成，抑制·OH所致的小鼠线粒体的氧化损伤，减轻肿胀度。
W-HNP、A-HNP能够抑制H<,2>O<,2>引起小鼠红细胞溶血，W-HNP的溶血抑制率较低，而A-HNP的溶血抑制率较高。
5．虎奶菇菌核多糖激活巨噬细胞 (MФ)的免疫活性。虎奶菇菌核多糖W-HNP、A-HNP在0.5g/L剂量下，能够激活体外培养小鼠腹腔巨噬细胞(PMФ)的增殖；使PMФ的LDH、Na<+>K<+>-ATPase、Ca<2+>Mg<2+>-ATPase的酶活性显著增加；有较强的促进小鼠PMФ吞噬中性红的作用，同时LSZ的酶活性增强，相差显微镜和电镜观察亦表明多糖激活 PMФ，表现为体积增大、指状突起增加和胞浆内溶酶体等细胞器增加，使其吞噬活性增强。同时表明，A-HNP激活PMФ的免疫活性较W-HNP的强。
虎奶菇菌核多糖W-HNP、A-HNP能明显激活 PMФ的活性，促进PMФ的iNOS活性，显著提高分泌NO水平；显著提高PMФ分泌细胞因子IL-1、TNF-α的能力，使其抑制肝癌细胞株HepG2增殖。表明多糖的抗肿瘤作用是通过激活免疫细胞分泌细胞因子而起作用。
6．虎奶菇菌核多糖对糖尿病(DM)小鼠的降血糖作用。通过腹腔注射四氧嘧啶建立小鼠糖尿病(DM)模型。虎奶菇菌核多糖W-HNP、A-HNP分别在200mg/kg bw、100mg/kg bw的灌胃剂量下连续灌胃15 d后，①血糖分别降低了34.499％、46.820％，对四氧嘧啶引起的DM小鼠有明显的降血糖作用。而对正常小鼠血糖无影响；②提高DM小鼠的脾指数和胸腺指数；③使DM小鼠肝脏MDA含量明显下降，GSH明显升高，同时明显提高DM小鼠肝的SOD、CAT活性，其中A-HNP效果较W-HNP明显。表明W-HNP、A-HNP通过调节抗氧化酶类的活性，促进损伤的胰岛β细胞修复的作用，从而使DM小鼠的血糖下降。
通过W-HNP、A-HNP灌胃15 d后，①DM小鼠肝、肾的AST、ALT的活性显著提高，与正常组没有差异；②肝糖原含量明显增多，肌糖原的含量增加较少；③同时DM小鼠肝GK、肌肉HK活性升高；④LDH同工酶电泳结果表明，DM组LDH酶带异常，多糖治疗组W-HNP、A-HNP的血清、肝、肾、心肌组织LDH酶带接近正常组。表明W-HNP、A-HNP能够改善DM小鼠糖代谢的紊乱，增强肝细胞糖原合成和葡萄糖分解代谢的功能，从而降低血糖。