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目的:观察神经干细胞在体外培养条件下是否有向胶质瘤细胞趋向的特性。
方法:1.从胎小鼠脑组织中分离出神经干细胞,采用神经干细胞克隆悬浮法,选用DMEM／F12培养液,添加无血清培养添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮细胞生长因子(EGF)进行体外扩增培养,机械消化的方法分离连续传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,并采用免疫荧光化学法检测神经干细胞标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达,免疫细胞化学法检测分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达；2.用Transwell细胞小室作神经干细胞对胶质瘤细胞趋向性实验:实验组取C6胶质瘤细胞悬液,对照组取3T3成纤维细胞悬液,空白组取无血清培养基,各组600μl分别加入细胞培养室的下室；所有培养室的上室加处于对数生长期的神经干细胞悬液200μl,将Transwell细胞小室放入培养箱中共同培养,光镜下计数从上室上表面迁移至下表面的神经干细胞数；3.预诱导神经干细胞对胶质瘤细胞趋向性实验:在神经干细胞悬液中加入10％胎牛血清和维甲酸(0.5μg／ml)进行预诱导5小时作实验组,对照组取未诱导神经干细胞悬液,空白组取预诱导神经干细胞悬液各200μl加入细胞培养室的上室；实验组和对照组下室加C6胶质瘤细胞悬液600μl,空白组下室加无血清培养基600μl,将Transwell细胞小室放入培养箱中共同培养,光镜下计数从上室上表面迁移至下表面的神经干细胞数。
结果:1.从胎鼠脑组织分离的细胞在含有无血清培养添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子的神经干细胞培养液中,能形成大量悬浮的神经干细胞球,经免疫荧光化学法鉴定,巢蛋白抗体标记阳性,免疫细胞化学法鉴定分化后的神经元、胶质细胞的特异性抗原NSE及GFAP表达阳性；2.在未预诱导神经干细胞对胶质瘤细胞趋向实验中,从上室上表面迁移至下表面的神经干细胞数分别为221.50±34.46(实验组),86.50±23.09(对照组)和24.00±11.15(空白组),实验组迁移的神经干细胞数明显多于对照组及空白组,三者比较差异有显著统计学意义(P<0.05)。3.预诱导神经干细胞对胶质瘤细胞趋向实验中,从上室上表面迁移至下表面的神经干细胞数分别为247.00±45.18(实验组),212.50±34.46(对照组)和30.00±11.15(空白组),实验组迁移的神经干细胞数明显多于对照组及空白组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。
结论:1.本研究分离培养出了神经干细胞,方法简单有效。2.本研究观察到神经干细胞在体外有向胶质瘤细胞趋向的特性。3.本研究观察到预诱导状态下神经干细胞有比未诱导神经干细胞更强的向脑胶质瘤细胞趋向的趋势。