肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界肿瘤患者的致死率中高居第三位,每年约有75万新发病例。随着对流行病学认识的提高及外科手术水平的提高,HCC患者的预后虽得到改善,但其5年生存率仍仅为26%。HCC发生发展的具体分子机制尚未明确,能够用于预测生存或作为治疗靶点的生物标志物仍十分有限。因此,探索HCC可靠的生物标志物及相关发生发展机制对于HCC的早中期诊断、评估预后、预测复发及靶向治疗等具有重要意义。B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)被认为是肿瘤的一个新的标志物。人类Bmi-1基因位于10号染色体(10p11.23),包括10个外显子和9个内含子。其编码的蛋白包含一个保守RING指结构域的N末端和一个中央螺旋-转角-螺旋-转角基序(H-T-H-T),该结构用于诱导端粒酶活性。Bmi-1是多梳蛋白复合体1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的核心成员之一,它可以改变染色质结构并调节一些重要的基因的转录,如INK4A/ARF位点,一个编码重要肿瘤抑制蛋白p16INK4a和p14ARF的基因。Bmi-1与肿瘤的发生、自我更新、增殖和化疗耐药有关。据报道,在HCC肿瘤组织中Bmi-1的表达高于相应的非肿瘤肝组织。然而,Bmi-1在HCC发生发展中的机制仍不清楚。微小RNA(miRNA)是一种小的非编码RNA,由大约19-25个核苷酸组成,可在转录后调节基因表达。Mi RNA通过碱基配对与目标m RNA的部分互补位点(通常在3’非编码区)结合,负性调控基因的表达。Mi RNA与目标m RNA结合将抑制翻译过程,并导致核酸外切m RNA降解。现已发现,许多miRNA在多种类型的肿瘤中出现表达失调,且与肿瘤诊断、分期、进展、预后和临床治疗的疗效密切相关。Mi R-203被认为是一个抑癌基因,在多种肿瘤中表达下调。既往的研究证明miR-203可以直接作用于基因ZEB1/2和SNAI1/2的m RNA。这些基因在以下两个过程中起着关键的调节作用:上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和间质-上皮转化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)。这两个过程都与恶性肿瘤的转移和预后有关。此外,miR-203在调节干细胞的自我更新和增殖过程中发挥至关重要的作用。迄今为止,有关miR-203与Bmi-1在HCC中的研究较少,本研究通过荟萃分析及免疫组化揭示了miR-203和Bmi-1与肝癌患者预后密切相关,且通过生物信息学发现了miR-203与Bmi-1的两者在肝癌组织中的相关性,接着通过免疫荧光素酶报告验证了miR-203对Bmi-1的直接靶向作用,并用细胞功能实验验证了miR-203通过Bmi-1调控肝癌细胞的增殖能力。第一部分Bmi-1在实体瘤中的表达对亚洲和高加索患者的预后作用:一项荟萃分析研究目的:通过荟萃(meta)分析以评估Bmi-1在实体瘤的表达对患者预后的作用。研究方法:通过搜索Pubmed,Embase和科伦图书馆三个数据库中相关Bmi-1在肿瘤中表达与预后的临床实验(终止时间为2014年8月)。结果:本研究共纳入39篇文献,40项研究。Bmi-1在亚洲人群和高加索人群中的预后作用相反。在亚洲患者中,Bmi-1高表达是一项负性预后指标(HR=1.96,95%CI1.62-2.36,P<0.001),但在高加索患者中则是良性预后指标(HR=0.77,95%CI0.63-0.93,P=0.006)。随后,我们在这两种人群中根据不同的肿瘤类型分别进行了亚组分析。在亚洲患者中,Bmi-1高表达的食管癌(HR=1.93,95%CI 1.52-2.46,P<0.001),胃癌(HR=1.50,95%CI 1.22-1.85,P<0.001),肺癌(HR=1.73,95%CI 1.05-2.85,P=0.031),子宫颈癌(HR=2.80,95%CI 2.26-3.47,P<0.001)和结直肠癌(HR=3.36,95%CI 2.19-5.15,P<0.001)患者总生存期较差,而Bmi-1高表达与乳腺癌和肝癌患者的总生存期无统计学意义。在高加索患者中,Bmi-1在乳腺癌的高表达提示生存期较长(HR=0.70,95%CI 0.51-0.97,P=0.031),而在食管癌却无预后意义。结论:Bmi-1高表达与亚洲食管癌、胃癌、肺癌、结肠直肠癌和宫颈癌患者的不良预后密切相关,但在肝癌中的预后作用仍存在争议。第二部分组织和循环microRNA-203在实体瘤中的预后价值:基于荟萃分析及TCGA数据库研究目的:通过荟萃分析及癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)TCGA数据库评估miR-203在实体瘤的表达对患者的预后作用。研究方法:通过搜索Pub Med,Embase和Cochrane Library(截至2016年3月)纳入相关研究,并进行进一步质量评估。此外,通过UCSC肿瘤基因浏览器项目下载TCGA所有实体瘤患者miR-203的表达与临床资料。结果:通过筛选,共纳入31项研究,肿瘤组织中miR-203的表达与各种肿瘤患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)差异无统计学意义。亚组分析结果表明,结直肠癌(HR=1.81,95%CI 1.31-2.49,P<0.001)和胰腺癌(HR=1.19,95%CI1.09-1.31,P<0.001)组织中miR-203表达水平的提高,预示着患者的OS较差,但在肝癌(HR=0.52,95%CI 0.28-0.97,P=0.040)和食管癌(HR=0.41,95%CI 0.25-0.66,P<0.001)中的结果却相反。TCGA数据库数据分析,在胰腺癌和食管癌得到类似结论,在结直肠癌和肝癌结果有所不同。此外,结直肠癌和乳腺癌患者血液中miR-203水平的提高与较差的OS和PFS显著相关。结论:肝癌和食管癌原发组织中miR-203低表达与患者的不良预后显著相关,而结直肠癌和胰腺癌组织中miR-203高表达则提示预后差,结直肠癌和乳腺癌循环miR-203水平较高的患者预后较差。第三部分Bmi-1在肝细胞肝癌中的表达及其与患者预后的关系研究目的:Bmi-1在多种恶性肿瘤中表达异常,并可作为一种肿瘤预后标志物。探究Bmi-1在HCC的表达水平和预后价值。研究方法:我们通过免疫组织化学法,对90例HCC的临床组织样本和TCGA数据库进行了研究,评估Bmi-1在HCC的表达及其预后作用。结果:Bmi-1蛋白和m RNA在HCC组织中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.001)。Cox回归多因素分析显示,Bmi-1的表达是HCC患者的一个显著独立预后指标(HR=2.38,95%CI=1.25-4.54,P=0.009)。我们建立了整合Bmi-1和TNM分期的列线图,结果显示,它在评估HCC患者预后方面更具优势。结论:Bmi-1作为HCC一项独立预后因素,可以更精准地预测HCC患者的生存。第四部分MicroRNA-203通过Bmi-1调控肝癌细胞的增殖能力研究目的:探讨miR-203对Bmi-1的调控机制以及对HCC细胞生物学行为的影响。研究方法:分析TCGA中367例同时具有Bmi-1和miRNA表达的HCC组织。通过Spearman相关性分析,筛选出目标miRNA。并通过免疫荧光素酶确定两者的调控关系及结合位点。此外,通过在肝癌细胞转染过表达载体,进行miRNA和Bmi-1的功能研究。结果:Bmi-1与miR-203在肝癌组织中的表达存在明显负相关(r=-0.275,P<0.001)。此外,miR-203在HCC的表达水平显著低于相邻的正常肝组织(P<0.001)。免疫荧光素酶证实Bmi-1是miR-203的直接作用靶基因。我们证实了在肝癌细胞中过表达Bmi-1后增殖能力明显升高,而过表达miR-203则增殖能力明显降低。另外,补救实验证实在过表达miR-203的肝癌细胞株上,同时过表达Bmi-1,肝癌细胞株的增殖能力得到恢复。结论:肝癌中miR-203通过靶向调控Bmi-1的表达,从而影响细胞的增殖能力,而不是侵袭能力,miR-203在肝癌发生及发展中起抑癌基因的作用,miR-203/Bmi-1有望成为肝癌中一个新治疗靶点及预后指标。