目前,非传染性疾病是全球人群的主要死因,癌症预计成为21世纪阻碍人类期望寿命增长的唯一疾病。肺癌发病隐匿,进展速度快,预后不良,美国的5年生存率约为16%,英国则不到10%,已经成为世界上最致命的恶性肿瘤之一。在中国,男性癌症患者中,肺癌发病率(21.9%)和死亡率(26.4%)均排第一位,在女性癌症患者中,发病率(13.3%)排第二位,仅次乳腺癌,死亡率(11.1%)排第一位,已然成为我国社会发展的重大公共卫生问题。肺癌晚期好发远处转移,骨骼是其常见血行转移靶器官之一。其中,肺腺癌骨转移发生率最高,以溶骨性破坏为主,易继发骨相关事件,严重影响患者的日常生活及生存时间。肺癌骨转移的治疗仍面临巨大挑战,大力提倡因病情而异的综合治疗,合理定制个体化治疗方案。寻求疾病的差异基因和诊断的分子标志物,有助于阐明肺癌骨转移的相关分子机制,推动基因靶向治疗的进程。RNase L是体内一种独特的核酸内切酶,被视为细胞增殖和迁移的负调控因子,其突变增加恶性肿瘤的发生风险。研究表明,RNase L在巨噬细胞(破骨细胞前体)中高表达,对破骨细胞分化及凋亡有重要的调控作用。因此,探究RNase L基因在肺癌溶骨性转移发生发展中的潜在机制具有显著意义。中医学对肺癌骨转移有着独特而深刻的理论认识,临床复方应用广泛,在整体观念和辨证论治的指导下,理法方药有机结合,实现全方位、分阶段、多靶点的干预,可以贯穿患者治疗的始终。探索中医药抗肺癌骨转移机制一直处于方兴未艾之势,强调与现代医学相结合,进行取长补短,为祖国医学的发展注入新的血液。近些年来,中医药在调控肿瘤转移微环境的优势逐渐凸显,从分子水平不断深入挖掘骨转移机理,从而更好地指导临床应用。通过长期的临床实践,证实固本解毒方治疗的有效性,为骨转移患者减轻痛苦和延长生存期带来福音。因此,探索肿瘤转移微环境对破骨细胞分化的影响,并进行固本解毒方的干预,可能为肿瘤骨转移治疗提供全新思路。鉴于此,本研究以RNase L为核心和固本解毒方为干预措施,从不同角度探索肺癌骨转移潜在的分子机理,主要内容分为两个部分进行:1.基于生物信息学数据库分析RNase L与各种肿瘤之间的潜在关系。2.RNase L调控肺癌溶骨性转移机制初探及固本解毒方的干预作用。1.基于生物信息学数据库分析RNase L与各种肿瘤之间的潜在关系目的:探索RNase L基因在各种恶性肿瘤中的变异及表达情况,构建RNase L蛋白互作网络,进行功能和通路的富集分析,为进一步探究RNase L与肿瘤的潜在关系提供新的方向,为下一步体外细胞实验奠定理论基础。方法:利用CbioPortal网络平台分析RNase L在TCGA PanCan数据库涉及的所有癌症中出现突变、扩增、缺失等情况,观察RNase L基因变异与肿瘤发生的潜在关系。结合GEPIA在线数据库分析RNase L在所有癌症中的表达水平以及与患者总生存率的关系,找寻与RNase L显著相关的肿瘤。然后,通过STRING进行RNase L蛋白互作分析,构建蛋白质—蛋白质互作网络图。此外,选取互作强度居前10位的互作蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,主要涉及生物学过程、分子功能、细胞学组分以及介导的信号通路。结果:(1)RNase L基因在大部分肿瘤中均存在基因变异,肺腺癌和肺鳞癌具有多重基因改变,出现频率由高到低的变异依次为增进、扩增、浅缺失、突变。乳腺浸润性癌、肝癌、卵巢癌以扩增为主;子宫癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤以突变为主;子宫颈癌、睾丸癌、胃癌、葡萄膜黑色素瘤以增进为主;肾嫌色细胞癌、肉瘤、头颈部癌、前列腺癌、脑低级别胶质瘤以浅缺失为主;肾乳头状细胞癌以深缺失为主。RNase L蛋白在卵巢浆液性囊腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤中显著低表达,仅在胰腺癌中显著高表达。此外,肾透明细胞癌、脑低级别胶质瘤、卵巢浆液性囊腺癌、间皮瘤和肉瘤的生存率均与RNase L的表达水平呈显著相关。(2)RNase L蛋白的相互作用蛋白质由互作强度从强到弱前10位分别为ABCE1、OAS3、OASL、ISG15、OAS1、MX1、OAS2、RSAD2、IRF3 和 IFIT1。GO功能富集分析结果显示:RNase L主要富集I型干扰素效应、病毒基因组复制、病毒生命周期的负调控、病毒防御反应等生物学过程;线粒体基质、真核起始因子复合体、宿主细胞、脂滴等细胞组分;双链核糖核酸结合、腺苷酸转移酶活性、核苷酸转移酶活性、核糖核蛋白复合体结合等分子功能。KEGG通路富集分析结果显示:RNaseL主要富集在丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒、人乳头瘤病毒等病毒感染的通路。Toll样受体信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路、维甲酸诱导基因Ⅰ样受体信号通路等转导途径。结论:本研究系统分析了 RNase L基因变异与各种肿瘤发生发展的潜在联系,并发现RNase L蛋白表达水平与一些肿瘤患者的生存率显著相关。另外,将RNase L的互作用蛋白进行功能注释和通路富集,进一步阐明RNase L与肿瘤发生机制的相关性。本研究结果初步证明,RNase L基因突变增加了肿瘤发生的风险,为临床抗癌治疗提供潜在的分子靶点。2.RNase L调控肺癌溶骨性转移机制初探及固本解毒方的干预作用目的:探讨RNase L基因与固本解毒方对A549细胞增殖和迁移的影响和RNase L基因及肿瘤转移微环境对破骨细胞分化的调控作用。方法:体外培养A549和A549-RNase L KD细胞,制备固本解毒方含药血清对其进行干预,采用MTT和划痕的实验方法,以吸收光密度值和划痕愈合面积为测量指标,观察RNase L及不同剂量含药血清对肺癌细胞增殖迁移的影响。此外,构建靶向 RNase L-shRNA,并转染 RAW264.7 细胞和 A549 细胞,经 Western Blot法验证其有效沉默RNase L基因,抑制RNase L蛋白的表达。然后,采用Transwell共培养技术,引入外源性RANKL蛋白的方法,建立RAW264.7细胞向破骨细胞分化的模型,以TRAP染色阳性为检测指标进行破骨细胞计数,侧重研究RNaseL和肿瘤转移微环境在破骨细胞分化过程中的作用。结果:(1)药物类别和细胞种类的不同均会对A549细胞的增殖产生显著的影响,统计分析P<0.001。在A549正常组及A549 KD组中,中药组和西药组与自身对照组比较均有显著性差异,中药组P<0.05,西药组P<0.01。结合抑制率,表明中药和西药均抑制A549细胞的增殖,且西药组效果优于中药组。另外,不同剂量的固本解毒方含药血清的抑制率由高到低排序为:1%>3%>5%>7%>10%>13%,进一步表明低剂量中药血清对A549细胞增殖的抑制效果较明显。此外,对于同种含药血清,正常组OD值高于RNase L-KD组,且抑制率低于RNaseL-KD组,分析可得P<0.01,具有统计学意义。表明RNase L基因可能具有促进A549细胞增殖的作用。(2)药物类别和细胞种类的不同均会对A549细胞的迁移产生显著的影响,统计分析P<0.05。在A549正常及A549 KD中,中药、西药以及对照组三者之间的划痕面积,在0h均无差异,在6h、12h和24h时均产生显著性差异,P<0.01。结合愈合率,可见含药血清具有抑制A549细胞迁移的作用,抑制作用由强到弱分别为西药>中药>对照。此外,在同一时间下,对于同种含药血清,正常组划痕面积值小于RNase L-KD组,且愈合率高于RNase L-KD组,分析可得P<0.05,表明RNase L基因可能具有促进A549细胞迁移的作用。(3)RAW264.7+A549与 RAW264.7KD+A549;RAW264.7与RAW264.7KD;RAW264.7+A549KD 与 RAW264.7KD+A549KD,此 3 个组间比较均为 P<0.05,说明单核巨噬细胞敲除RNase L基因,抑制破骨细胞的分化。RAW264.7+A549与 RAW264.7;RAW264.7+A549KD 与 RAW264.7;RAW264.7 KD+A549 与RAW264.7 KD;RAW264.7 KD+A549 KD 与 RAW264.7 KD,此 4 个组间比较均为P<0.05,说明肿瘤转移微环境促进破骨细胞的分化。RAW264.7 KD+A549与RAW264.7KD+A549KD;RAW264.7+A549 与 RAW264.7+A549KD,此 2 个组间比较均为P>0.05,说明肿瘤细胞敲除RNase L基因,对破骨细胞的分化没有影响。结论:本研究利用 A549、A549-RNase LKD、RAW264.7、RAW264.7-RNase L KD四组细胞系,采用MTT、划痕、Transwell三种实验技术,对其进行固本解毒方的干预,分别以吸收光密度值、划痕面积测量值、破骨细胞计数值为指标,实验结果初步证实了 RNase L在一定程度上可以促进A549细胞的增殖和迁移,固本解毒方可以抑制A549细胞的增殖和迁移,且以低剂量效果为佳。另外,RNase L和肿瘤转移微环境均不同程度地促进了破骨细胞分化。