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目的:
肾间质纤维化是各种原因引起的慢性肾脏病变最后的共同结局,最终导致终末期肾功能衰竭。大量的研究表明,肾内肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)在肾脏纤维化发生中起着十分关键的作用。肾小管上皮细胞局部可产生血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)可促使小管上皮细胞表达各种致炎因子及细胞生长因子,引起小管上皮细胞肥大,增加细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积和降解减少,诱导肾小管上皮细胞发生表型转化,从而加速小管间质纤维化的进展。血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowthfactor,VEGF)是一种特异性的促进血管内皮生长及渗透的因子,具有增加血管通透性,促进内皮细胞增殖及血管维持功能。它在肾脏的发育,生理功能的维持,系膜,内皮的增生,蛋白尿的发生,炎症及损伤修复以及在肾间质纤维化中具有重要的作用。体内及体外试验已证明Ang Ⅱ能够刺激VEGF在肾脏中表达。目前已知的内生性VEGF选择性抑制剂是可溶性VEGF受体(sFlt-1),是一种肝磷脂凝结蛋白,sFlt-1与VEGF具有高亲和力,抑制VEGF的促有丝分裂作用。sFlt-1和KDR/FIK-1基因仅表达于血管内皮细胞,在由VEGF介导的血管形成过程中发挥选择性和内生性抑制作用。糖尿病肾病患者于早期尿中VEGF和sFlt-1排泄增加,给予VEGF抗体后,肾小球肥大减轻,蛋白尿明显减少,肾脏损伤进展延缓。然而,Ang Ⅱ对人近端肾小管上皮细胞VEGF及其可溶性受体SFLT-1的表达有何影响?是否能增加其表达,从而促进肾小管间质纤维化的进展?检索国内外文献相关报道极少。本课题利用体外培养的人近端肾小管上皮细胞,研究AngⅡ对肾小管上皮细胞VEGF及sFlt-1的表达及增殖的影响,并与高糖刺激做比较,以探讨Ang Ⅱ在肾间质纤维化中的作用及可能的发病机制。
方法:
1、人近端肾小管上皮细胞(HK-2)的培养:HK-2购自中国协和医科大学细胞中心,常规培养。
2、实验分组:空白对照组及不同浓度AngⅡ组(10,1nmol/L)和高糖组(25mmol/L)。观察不同时间点:6h、24h、48h。
3、应用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察AngⅡ及高糖(25mmol/L)对HK-2 VEGF及sFlt-1 mRNA表达的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察不同浓度的AngⅡ对HK-2增殖的影响。
4、本实验计量资料用x±s表示,使用SPSS13.0统计软件进行统计描述。
结果:
1、RT-PCR结果显示不同浓度Ang Ⅱ对HK-2VEGFmRNA表达的影响:加入AngⅡ1nmol/L 6h、24h、48h后,VEGF mRNA的表达量为对照组的1.721、1.590、1.000倍(P<0.01);加入10nmol/L AngⅡ后,VEGFmRNA的表达量分别为对照组的1.721、2.033、1.576倍(P<0.01)。
2、不同AngⅡ对sFlt-1 mRNA表达的影响:加入AngⅡ1nmol/L后,sFlt-1mRNA的表达量分别为的2.533、2.517、1.867倍(P<0.05)。加入AngⅡ10nmol/后,sFlt-1 mRNA的表达量分别为对照组的3.167、3.034、2.500倍(P<0.05)。
3、高糖环境下VEGF mRNA的表达量分别为1.525、1.295、1.322倍(P<0.05);sFlt-1 mRNA的表达量分别为对照组的0.767、0.7333、0.900倍,与对照组相比有下降趋势。
4、而MTT结果均显示AngⅡ促进HK-2的增殖(与对照组比较,P<0.01),随着Ang Ⅱ浓度的升高及作用时间的延长,表现出剂量和时间依赖性的趋势。
结论:
1、体外培养的人近端肾小管上皮细胞在正常培养条件下有VEGF及sFLT-1的表达。
2、AngⅡ促进人近端肾小管上皮细胞VEGF及其受体sFLT-1的表达增高,随着浓度及时间的增加,呈上升趋势。
3、Ang Ⅱ可以促进人近端肾小管上皮细胞增殖,随着浓度及时间的增加,呈上升趋势。
4、高糖环境下人近端肾小管上皮细胞VEGF表达明显增高,对sFLT-1无明显影响。
本研究提示:AngⅡ可能通过与高糖不尽相同的途径来促进VEGF及sFLT-1的表达,干预VEGF及sFLT-1可能会延缓慢性肾衰的进展,为临床治疗提供新的思路。