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在高等真核生物的细胞周期中,细胞通过一系列精确的调控保证每个细胞周期的基因组复制且只复制一次,从而保证基因组的完整性。为达到这个目的,真核细胞形成了一系列有序的步骤,将一些重要的复制前复合体(pre-Replication Complex)元件和复制体(Replisome)的元件在特定的时空位点组装到DNA复制起始点上去,同时通过这些重要的元件蛋白在特定时间点的磷酸化,解散或者降解,来防止DNA复制的重复起始。 基因组DNA的复制首先需要完成的任务是在细胞进入S期前组装复制前复合体pre-RC。这一过程包括6亚基蛋白复合体ORC对DNA复制源的识别,ORC复合体募集Cdc6/Cdc18到复制源上,进而募集Cdt1,最终由Cdc6/Cdc18和Cdt1共同募集Mcm2-7复合体。MCM复合体是真核细胞的DNA解旋酶。当MCM募集到染色矮上,DNA复制起始进入下一阶段,包括Cdc45、Sld3、RPA等一系列蛋白会结合到染色质上,接着募集Replisome的组成元件蛋白。复制前复合体的组装是DNA复制起始最重要豹调控步骤,它受到CDK(Cyclin-Dependent、Kinase)、DDK(Dbf4-Dependent Kinase)等蛋自激酶调控,在特定时间激活pre-RC;也受到Creminin的抑制,以及染色质结构对它的调控。虽然近几十年对pre-RC组装以及调控的研究不断深入,但在体外用生化方法重建pre-RC的努力除了在芽殖酵母中实现以外,在其它物种中都尚未能做到。这提示我们,有更多未发现的蛋白参与到DNA复制前复合体的缌装与调控中。 为了发现更多参与DNA复制调控的蛋白,我们利用裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的CAe18离表达株YMF234可以诱导基因组重复复制,细胞周期被阻滞在S期这一特性,诱变YMF234菌株并筛选在Cde18高表达背景下不发生基因组重复复制,细胞可以正常生长的突变株。这些突变株包含有在功能上可以拮抗Cdc18高表达的突变,并且带有温度敏感性。接着,为了定位这些突变株的突变基函,我们构建了一个酵母基因缀文库用来做互补实验。我们用随机酶切法得劐基因组片段,构建的基因组文库质粒含有平均长度为2.8kb的基因组片段,共有51000个不同质粒,因此对裂殖酵母1.4×10^7bp大小的全基因组形成了10倍的覆盖,可以基本保证文库包含有裂殖酵母所有的基因。接着,用这个文库对突变株进行转化互补,再经过质粒丢失实验剔除发生回复突变的突变株,得到确实由质粒互补了突变表型的突变株,并从中提取质粒测序,最终定位出突变基因和突变位点。我们目前成功互补了两个突变株,并定位了它们的突变基因,其中92PC9突变株的突变基因是nucleoporin Nup85基因,178PB1突变株的突变位点位于tRNA-Lys上游。这些筛选得到的突变株以及确定它们突变基因的工作,为我们进一步研究DNA复制调控提供了新的思路和研究工具。