论文部分内容阅读
为了研究了解目前广州地区志愿无偿献血人群的HCV感染现状,在2004-2007年期间,共有559,890位志愿无偿献血者被广州血液中心招募进行了首次献血,其中1,877位志愿无偿献血者为抗—HCV阳性,其抗—HCV阳性率为0.335%。并在该1,877位抗—HCV阳性血浆样本中随机抽取450份HCV抗体阳性的血浆样品应用于本研究中。运用荧光定量PCR的方法来筛选其中的HCV RNA阳性的血浆,结果270份血浆为HCV RNA阳性,另外180份为HCV RNA阴性血浆。从HCV RNA阳性血浆中分离病毒RNA,并使用随机引物逆转成cDNA,然后通过巢式PCR扩增HCV E1和NS5B区的基因片段。将得到的PCR片段进行PCR引物双向测序,对得到的序列信息进行HCV精确的基因分型和病毒分子进化分析。根据测序得到的E1基因和NS5B基因序列,我们对236份样品(236/450,52.4%)进行了基因型和基因亚型的确定。在该236份样品中,97份(41.1%)为HCV1b基因型,82份(34.8%)6a,18份(7.6%)2a,15份(6.4%)3a,17份(7.2%)3b,3份(1.3%)1a,2份6e(0.8%)和2份6n(0.8%)。分型结果显示HCV1b和6a(75.9%,179/236)是目前在广州地区无偿献血人群中最主要流行的HCV基因型。根据E1和NS5B区基因序列进行分子进化分析,构建系统进化树,结果表明在本实验中分离到的HCV1b株主要分布在A,B两个簇中,同时出现其它的C,D,E三个分支。82份HCV6a的E1和NS5B区基因序列的进化分析显示主要分布在Ⅰ,Ⅱ,和Ⅲ三个簇中。
HCV6基因型已经发现了21个基因亚型,6a—6u,新的病毒株不断被发现。KMN02,KM046和KM181三个病毒株属于HCV6基因型,为了进一步进行精确的亚型分型,对该三株病毒进行全基因组测序。通过RT—PCR的方法从感染HCV病毒的病人血浆中分离HCV基因组,DNA直接测序和系统进化分析表明:KMN02,KM046和KM181的基因组长度分别为9461、9429和9461个碱基,ORF的长度均为9051个碱基。该三株病毒基因组序列的相似度为95.3%—98.1%,并且和其它23条HCV6亚型的全基因序列相似度为72.2%—75.4%。该23条参考全基因序列为亚型6a—6u和两条尚未明确亚型的km41和gz52557病毒株。系统进化分析表明,该三株HCV病毒属于HCV基因型6,但是不属于已有的亚型。根据HCV基因分型的标准,该三株病毒是属于新的亚型,被命名为HCV6v。通过对E1和NS5B的序列片段分析在基因数据库中发现有两个相关的病毒株:CMBD14和CMBD86。通过测序得到该三株病毒的全基因组序列并正式命名为HCV6v。