稻瘟病是世界范围内的水稻灾变性病害,严重影响农业生产的可持续发展。同时稻瘟病菌Magnaporthe oryzae是植物与病原真菌互作研究的模式生物,其致病机理的研究是植物病理学重要组成部分。随着基因组数据库的应用,稻瘟病菌基因功能的研究更加迅速,细胞器在病菌发育及致病过程中的作用也逐渐得到关注,如过氧化物酶体、伏鲁宁体、内质网等。过氧化物酶体(peroxisome)是一种单层膜包被的细胞器,是β-氧化与乙醛酸循环的重要场所。病原茵在侵入和定殖过程中,寄主会产生大量的活性氧以抵御入侵,病原菌必须克服活性氧的影响才能成功寄生,而活性氧的降解也离不开过氧化物酶体。参与过氧化物酶体形成的基因称为PEX基因。过氧化物酶体膜蛋白与基质蛋白在细胞质中合成,分别靠自身序列所具有的过氧化物酶体定位信号(Peroxisome targeting signal)mPTS与PTS而被识别和转运进入基质内部。根据序列和位置的不同,过氧化物酶体基质蛋白定位信号分两种(PTS1与PTS2)。PEX5与PEX7基因分别编码PTS1与PTS2的特异性受体。过氧化物酶体膜蛋白定位信号mPTS,主要是由可溶性的分子伴侣Pex19p进行识别和转运,从而完成过氧化物酶体膜蛋白的形态发生。Pex5p与Pex7p在稻瘟病菌致病过程中的作用已有研究,而膜蛋白的受体Pex19p在植物致病真菌中作用机制尚不清楚。因此,本文首先对稻瘟病菌中的PEX19基因(MoPEX19)开展了功能分析,结果如下：a)在稻瘟病菌数据库中搜索获得与酿酒酵母ScPEX19高度同源基因MGG 00971。将MGG 00971基因导入酿酒酵母突变体Ascpexl9,能够恢复Ascpex19在油酸上的生长缺陷,表明了MGG 00971与ScPEX19功能同源。因此,MGG 00971即为稻瘟病菌中的PEXl9同源基因,命名为MoPEX19。b)蛋白亚细胞定位表明,大部分Mopexl 9p分布于细胞质中,少部分与过氧化物酶体标记RFP-PTS 1共定位,我们认为Mopexl9p定位于细胞质和新形成的过氧化物体。c)MoPEX19的缺失造成过氧化物酶体基质蛋白与膜蛋白的错误定位；同时伏鲁宁体标记蛋白Hexl错误定位于细胞质中。进一步透射电镜观察表明,MoPEX19突变体中过氧化物酶体与伏鲁宁体消失。d)MoPEX19的敲除严重影响了稻瘟病菌的生理生化代谢,突变体生长速度变慢、茵落平塌、气生菌丝减少,黑色素化程度降低：分生孢子产量及存活率显著下降；另外病菌脂质利用能力遭到破坏,活性氧耐受性降低,细胞壁的完整性受到影响。e)MoPEX19敲除后稻瘟病菌的生长发育过程也受到影响,Δmopex19突变体的孢子萌发率及附着胞形成率显著降低；突变体的茅管和附着胞周围,有明显的细胞质渗漏现象,而且随着茅管的伸长附着胞膨大,渗漏逐渐加重：分生孢子培养24小时后,突变体孢子内仍可见较多残留的脂类；突变体附着胞膨压与野生型相比明显降低。f)Δmopex19突变体不能在水稻和大麦叶片表面形成病斑,不能够形成有效侵染。表明,MoPEX19为稻瘟病菌致病所必需,基因的缺失导致致病性完全丧失。过氧化物酶体增殖(Peroxisomal proliferation)是指成熟的过氧化物酶体通过分裂形成新的过氧化物酶体。过氧化物酶体的数量能根据生化代谢的需要而迅速增加,主要依赖于过氧化物酶体增殖。相对于过氧化物酶体的形成,过氧化物酶体增殖机制的研究相对滞后。PEX11是已知调控过氧化物酶体增殖的最关键基因,该基因作用机制是近年来相关研究的一个热点。但到目前,植物病原真菌中过氧化物酶体增殖过程及机制的研究鲜有报道。因此,分析稻瘟病菌PEX11基因的功能,探索稻瘟病菌的过氧化物酶体增殖机制,对病原真菌致病机理及过氧化物酶体增殖机制的研究都有重要意义。通过检索,我们发现稻瘟病菌中包含3个可能的PEX11基因,MoPEXl1A, MoPEX11B,MoPEX11c。本文对这3个基因进行了单敲、双敲和三敲除,结合蛋白定位与基因表达,明确了3个基因在过氧化物酶体增殖、病菌生长发育及致病性中的功能,结果如下：a)MoPEX11A、MoPEX11B、MoPEX11C在菌丝、孢子、附着胞中的表达水平都比较低。b)MoPEX11A突变体中过氧化物酶体数量变少、体积增大,同时伏鲁宁体从过氧化物酶体的脱落受到影响：而MoPEX11B与MoPEX11c的敲除对过氧化物酶体的数量和大小无显著影响。另外,MoPEX11A的过表达导致过氧化物酶体不能正常地分裂。c)MoPEX11A缺失导致稻瘟病菌致病性降低。探索致病性下降的原因,我们发现MoPEX11A缺失导致分生孢子萌发率、附着胞形成率、附着胞膨压以及分生孢子侵染率降低。另外,MoPEX11A缺失还影响了稻瘟病菌细胞壁的完整性以及稻瘟病菌的有性生殖。d)通过构建并转化不同抗性的敲除载体,我们获得了这三个基因的双敲及三敲突变体,检测单敲、双敲及三敲菌株的脂肪酸利用率,发现MoPEX11A与MoPEX11c基因对于稻瘟病菌的脂肪降解起重要作用。e)双敲突变体还是三敲突变体,致病性下降程度较MoPEX11A单敲突变体无明显差异,进一步表明MoPEX11B与MoPEX11C对病菌致病过程无影响。n通过定量PCR检测MoPEX11A,B,C敲除对相关基因表达量的影响,发现MoPEX11A敲除后MoPEX11B与MoPEX11C表达量变化不大：而MoPEX11B或MoPEX11C敲除后,MoPEX11A表达量显著增加：MoPEX11A,B,C敲除后.MoPEX3表达量增加：Acoly基因在MoPEX11基因发生变化时上调表达。相对于基质蛋白的定位机制,过氧化物酶体膜蛋白的定位机制相对复杂,在过氧化物酶体标记中的应用也较少。我们对稻瘟病菌中的3个过氧化物酶体膜蛋白Mopmp4、Mopex14、Mopmp47进行了荧光定位分析,比较了三种蛋白的的定位及其与PTS1、线粒体、伏鲁宁体位置的异同,为进一步研究这3个基因的功能和过氧化物酶体的多荧光标记奠定了基础。主要结果如下：a)Mopmp4、Mopex14、Mopmp47分别与GFP融合,在MPG1启动子的作用下表达,在稻瘟病菌细胞中均呈现点状定位。b)Mopmp4背景较严重：MoPEX14荧光点较多,但与PTS1不完全共定位,Mopmp47荧光点多位于分生孢子的前端；且Mopmp47定位的菌株中荧光点较大,推测Mopmp47的过表达可造成过氧化物酶体增大。c)在野生型菌株中,线粒体标记蛋白Mofow1与过氧化物酶体标记PTS1不共定位；同样的,MoPEX14、MoPMP47与线粒体染料]mitO tracker也不重合。PEX14与伏鲁宁体标记蛋白HEX1部分共定位,且荧光点多集中在分生孢子隔膜上。d)MoPEX5、MoPEX6、MoPEX7基因的缺失不影响MoPMP4、MoPEX14、MoPMP47的点状定位。MoPEX19的敲除阻断膜蛋白MoPMP47的定位：但Δmopex19突变体中PEX14基因仍呈现点状,推测过氧化物酶体消失后MOPEX14定位于另外的细胞器。综上所述,本研究对过氧化物酶体膜蛋白受体基因MOPEX19与过氧化物酶体增殖相关的基因MoPEX11A、MoPEX11B、MoPEX11C在稻瘟病菌过氧化物酶体形成和增殖,以及病菌生长发育和致病性中的作用进行了探索。结果表明,MoPEX19蛋白分布于细胞质与过氧化物酶体上：基因缺失造成过氧化物酶体与伏鲁宁体消失,从而影响了病菌脂肪利用与活性氧降解,并造成一系列的生长发育缺陷,最终导致致病力丧失。稻瘟病菌PEX11家族的3个基因MoPEX11A,B,C在菌丝、孢子、附着胞中的低水平表达；MoPEX11A、MoPEX11c定位于过氧化物酶体,而MoPEX11B可能定位于内膜系统；MoPEX11A的缺失导致过氧化物酶体数量变少、体积增大,伏鲁宁体无法正常脱落,同时MoPEX11A过表达导致过氧化物酶体无法分裂；MoPEX11A在脂肪降解、细胞壁形成、孢子萌发、附着胞形成、附着胞膨压、有性生殖、病菌穿透与致病过程中起着重要作用；MoPEX11C仅对病菌脂肪降解有一定作用。另外,我们还对3个过氧化物酶体膜蛋白基因MoPEX14、MoPMP47、MoPMP4的定位及与不同细胞器的共定位情况进行了荧光观察。本研究的结果对进一步揭示丝状真菌细胞器的形成机制及植物病原真菌致病机理具有重要意义,并有可能为稻瘟病的防治提供药物筛选靶点。