论文部分内容阅读
毛白杨生长迅速,树干通直挺拔,是我国重要的速生用材树种和园林绿化树种,在我国林业经济、生态建设和城乡绿化中发挥着重要的作用。但病虫危害严重影响毛白杨的正常生长,而叶色单一在一定程度上影响了毛白杨的观赏度。随着生物技术的发展,利用多基因聚合转化技术创制同时具有抗虫和彩叶特性的毛白杨新材料,对于毛白杨种质创新具有重要意义。Btcry Ⅱ基因编码的毒蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂Bbi基因对鳞翅目害虫具有高毒力,CmOr基因可调控类胡萝卜素含量以改变叶色,本实验采用IRES元件构建了多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOrIRES-Luc;利用农杆菌介导法将其和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi分别转入毛白杨TC1521无性系中,通过抗性筛选、PCR鉴定获得一批转基因阳性植株;进一步通过RT-PCR、qRT-PCR对外源基因的表达情况进行了分析,为后续进行抗虫试验、叶片色素测试等生理生化指标分析奠定了工作基础。本研究主要结果如下:1.以pCAMBIA1304质粒为骨架,构建了基于IRES元件的多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc,通过PCR检测,证明外源基因Btcry Ⅱ和CmOr已经成功整合到表达载体上。2.利用冻融法将多基因表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi导入农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导法将其分别转入毛白杨TC1521,经过植物组织培养和潮霉素(Hyg)筛选,得到40株转抗虫、彩叶双价基因的生根抗性苗和18株转Bbi基因的生根抗性苗。经PCR鉴定,获得双价基因阳性植株8株和抗虫基因Bbi阳性植株7株。3.采用RT-PCR和qRT-PCR技术,对8个转双价基因的阳性植株进行外源基因的表达分析,检测结果表明,在其中7个转基因株系中都能够检测到Btcry Ⅱ和CmOr基因,且相对表达量明显高于野生型植株(WT);对7个转Bbi基因阳性植株进行RT-PCR检测,在2个转基因株系中检测到该基因的转录本,说明Bbi基因不仅已经整合到毛白杨TC1521的基因组中,而且能够正常转录。4.对上述7个转Btcry Ⅱ、CmOr双价基因株系和2个转Bbi抗虫基因株系进行扩繁,共获得转双价基因植株24株,转Bbi抗虫基因植株16株,并移栽到温室进行培养。这些工作为后续抗虫测试和叶片色素分析奠定了工作基础。