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红霉素A（Erythromycin A,ErA）是红色糖多孢菌在次级代谢过程中合成产生的一类大环内酯类抗生素,具有日益增长的临床应用需求。因此,利用基因工程技术改造宿主菌,获得高产菌株,提高其工业产量仍是其研究的重中之重。随着新型基因组编辑技术的发展,改造合成基因簇、调控基因表达等干扰策略越来越受到研究人员的重视。红色糖多孢菌属于高GC含量的放线菌,基于传统的同源双交换原理的基因编辑技术效率低、操作周期长,严重限制了红色糖多孢菌基因改造的进程。对于红霉素A等次级代谢产物产量的提高则需要一种更为高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9系统广泛应用于许多物种的基因编辑,在放线菌属的天蓝色链霉菌中已经有基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,但是红色糖多孢菌中缺乏有效的CRISPR-Cas9编辑工具。本研究应用CRISPR-Cas9高效基因编辑系统对红色糖多孢菌进行基因工程改造,包括敲入组成型强启动子、定点整合增加前体合成的酶,CRISPRi优化代谢流,构建并筛选得到红霉素A高产工业菌株。本研究率先开发了应用于红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。主要研究内容如下:应用CRISPR-Cas9系统编辑红色糖多孢菌基因组。温敏性质粒骨架上构建PermE启动子驱动的Cas9表达模块;并用Pj23119和PkasO启动子驱动sgRNA的转录,构建由特定sgRNA引导的靶向性CRISPR-Cas9编辑系统。结果表明,应用CRISPR-Cas9基因编辑系统,由单一sgRNA引导的编辑效率为13%,利用双sgRNA靶向的编辑效率提高到65%,并成功应用于无痕敲除indA（SACE1229）。在工业菌株Ab（HP）中敲除SACE1765,使得红霉素产量提高了 12.7%。利用此技术,通过在SACE0712敲入PermE-Flag-egfp,激活了野生菌中的红霉素生物合成基因簇中的部分基因,使得红霉素产量增加了 80.3%。双向启动子Pj23119-PkasO敲入提高红霉素产量。通过mCherry报告基因系统检测红霉素生物合成基因簇的启动子强度,选取SACE0720（eryBIV）-SACE0721（eryAI）间隔区作为靶标调控区域,在Ab（HP）中利用CRISPR-Cas9双sgRNA方法敲入组合的双向启动子Pj23119-PkasO,显著增强红霉素生物合成基因eryBIV和eryAI的转录水平（基因转录水平分别提高了32和79倍）,激活了红霉素生物合成基因簇。该重组菌株的红霉素产量随之提高了 58.3%。CRISPRi技术干扰基因表达。选择aceA和sdhA作为靶点,利用定点突变的dCas9构建的CRISPRi技术抑制靶基因的表达,结合温度调控sdhA的抑制强度,使得红霉素产量进一步增加了15.1%。应用CRISPR-Cas9在红色糖多孢菌中重构生物合成基因簇。利用双sgRNA靶向敲除红霉素工业高产菌Ab（HP）中的红霉素合成基因簇（ery BGC,49491 bp）,得到AbΔery菌株。该菌株具有提供甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A的潜力,有助于将红色糖多孢菌改造为以甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A为前体的其他次级代谢产物异源合成的底盘细胞。本研究构建了有效的红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。基于温敏性质粒的基因编辑框架,有利于多个基因重复多次的遗传操作;基于CRISPR-Cas9的基因组编辑系统,利用双sgRNA靶向、插入双向强启动子等策略,成功通过红色糖多孢菌的基因编辑和优化改造,提高了红霉素的产量。利用CRISPR-Cas9系统敲除红霉素生物合成基因簇,构建的底盘菌株,具有应用于异源合成甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A等为前体的重要次级代谢产物的潜力。