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猪δ冠状病毒（Porcine delta coronavirus,PDCoV）是 2012 年新发现的一种冠状病毒,PDCoV是猪的肠道病原体,它可以感染任何年龄的猪,临床症状包括呕吐、水样腹泻、脱水乃至死亡,这种流行病给中国养猪业造成了巨大损失。由于PDCoV在临床当中经常存在交叉混合感染,因此需要建立一种快速有效的PDCoV诊断方法。本研究原核表达并提纯了可溶性pET-32a-N重组蛋白。成功克隆了3株针对PDCoVN蛋白的单克隆抗体,为将来对PDCoV N蛋白进行抗原表位和功能分析,建立PDCoV的临床诊断方法和研发疫苗提供了可靠依据。同时,我们将制备的单抗作为免疫共沉淀中的抗体,联合质谱与生物信息学分析,鉴定到了 PDCoV N蛋白与TUBB2B互作。具体的研究内容如下:1.猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达与鉴定PDCoV N蛋白是病毒基因组编码的核衣壳蛋白,在病毒感染宿主细胞后表达量最多,较为稳定,是检测PDCoV的理想靶抗原。鉴于此,本研究以PDCoV/SD2018/10毒株的病毒RNA为模板,通过RT-PCR扩增出了1026 bp的N基因,连接在pET-32a原核表达载体上,转化进BL-21感受态细胞;0.5mM的IPTG用于诱导pET-32a-N重组蛋白在感受态细胞中表达,经SDS-PAGE和Western blot验证后,我们成功制备出可溶性pET-32a-N重组蛋白,分子量约为56kDa,并用Ni柱亲和层析技术完成了提纯。2.抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以纯化的pET-32a-N重组蛋白为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌性鼠,收集免疫鼠和空白鼠的血清作为阳性和阴性血清,建立了以pET-32a-N重组蛋白为抗原的间接ELISA方法;利用细胞融合和亚克隆技术,筛选到3株阳性杂交瘤细胞系,命名为4D3、4E3和3B4,都能长期地产生PDCoV N蛋白单抗。经间接ELISA测定,3株单抗的腹水效价均为1×10-6,抗体亚类均为IgG2aκ。通过Western blot与IFA鉴定,3株单抗均能与PDCoV/SD2018/10毒株发生特异性反应。3.猪δ冠状病毒N蛋白互作蛋白的初步鉴定为筛选出PDCoVN蛋白的互作蛋白,本研究以接种PDCoV/SD2018/10毒株的LLC-PK1细胞为感染组,以不接毒的LLC-PK1细胞为对照组,分别提取细胞总蛋白,通过免疫共沉淀法区分感染组和对照组的差异蛋白条带,经质谱分析初步筛选到了68个PDCoV N蛋白的潜在宿主细胞互作蛋白,通过生物信息学的GO、COG和KEGG注释挑选出了4个候选蛋白ANXA2、KRT8、SERPINH1和TUBB2B,并通过免疫共沉淀鉴定出了PDCoVN蛋白与TUBB2B互作。