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背景副溶血性弧菌是一种食源性致病菌，具有较强的生物膜形成能力，其在形成生物膜过程中，主要受QS系统调节。OpaR和AphA是副溶血性弧菌QS系统的两个核心调控子，在不同的菌密度条件下调控生物膜的形成。cpsQ和mfp基因座位紧密连锁，两者均与细胞表面特征有关，其转录受多个调控子的调控，如cpsQ的转录表达受CpsR的调控和CpsQ自调控。那么，OpaR和AphA对cpsQ和mfp是否存在直接调控关系呢？还需进一步验证。目的深入研究副溶血性弧菌QS系统核心调控子OpaR和AphA对生物膜相关基因cpsQ和mfpA的调控机制。方法利用自杀载体的方法构建副溶血性弧菌opaR和aphA基因的无痕非极性突变株；提取野生株与调控子基因突变株在特定培养条件下的总RNA，利用引物延伸实验研究mfpA与cpsQ的转录起始位点，并根据引物延伸条带的相对丰度，判定调控子蛋白对靶基因的调控关系；PCR扩增mfpA与cpsQ的整个启动子区DNA序列，纯化回收后，将其直接克隆入pHRB309质粒无启动子区β-半乳糖苷酶基因的上游，将重组质粒分别转入副溶血性弧菌野生株和调控子基因突变株中，通过测定二者中β-半乳糖苷酶活性差异，进一步验证调控子对靶基因的调控关系；分别扩增mfpA与cpsQ的整个启动子区DNA序列，并表达纯化副溶血弧菌His-OpaR与His-AphA重组蛋白，通过凝胶阻滞实验（EMSA）验证调控子蛋白对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用；最后通过DNaseⅠ足迹实验，验证调控子蛋白对靶基因启动子区具体相互作用的位点。结果AphA低密度表达，只有一个转录起始位点C（-200），其转录起始受密度抑制。OpaR高密度表达，也只有一个转录起始位点G（-74），其转录具有密度依赖性。低密度条件下： mfpA只有一个转录起始位点A（-70）（翻译起始位点为+1），其转录起始受AphA的抑制；体外实验表明，AphA能直接结合到mfpA启动子区-84和-129之间的碱基序列上。cpsQ也只有一个转录起始位点C（-70），且其转录起始也同样受AphA的抑制，但这种抑制是间接的。高密度条件下：mfpA和cpsQ的转录起始受OpaR的激活，其转录起始位点均同低密度条件。体外实验表明，OpaR能直接结合到mfpA启动子区-133和-177之间的碱基序列上，却不能直接与cpsQ结合，因此其对mfpA的激活是直接的，而对cpsQ的激活是间接的。mfpA和cpsQ基因的转录也是密度依赖性的，均只有一个转录起始位点，分别为A（-70）和C（-70）。结论在低菌密度条件下，AphA大量表达，进而直接抑制mfpA基因的转录，但间接抑制cpsQ的转录；在高菌密度条件下，OpaR大量表达，进而直接激活mfpA基因的转录，但间接激活cpsQ基因的转录；mfpA和cpsQ基因的转录与opaR和aphA基因一样，也受菌密度的调节，二者均在高密度下高表达。