原发性肝细胞癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,位居恶性肿瘤相关死亡原因的第三位,其中中国原发性肝细胞癌患者年死亡人数>20万,约占世界的53%。近年来,随着人们对肝癌的日益关注和重视及相关研究的逐渐深入,肝癌的发病原因及高危因素已基本明确,其发生发展过程中所涉及的病理变化也逐渐清楚,对高危患者的筛查方法更是得到了不断完善,但肝癌患者的术后生存时间并未得到明显提高。造成这种结果的主要原因是肝癌患者的病情比较隐匿,确诊时多为晚期,导致只有少数人可以接受根治性手术切除,多数肝癌患者只能接受姑息性手术,或依赖于化疗、放疗和其他如肝动脉栓塞化疗、无水酒精注射、射频消融、微波凝固等疗法,但这些方法治疗后易发生肝癌复发且远期疗效不理想。因此,深入研究肝癌的转移、复发的机制并探索有效的治疗措施仍是当前肿瘤研究的重点。目前,关于肝癌新的治疗理念是以外科治疗为主同时联合应用多种方法的综合治疗。研究证实,综合治疗较单一治疗在治疗效果上优势明显。在这方面,基因治疗可被视为一个潜在的辅助治疗措施,迄今为止,已经完成的临床实验均证实,基因治疗的副作用在大多数情况下处于可以接受的范围内。由于基因治疗的作用机制与传统的治疗不同,因此将基因治疗方法和传统治疗方案的合理组合可以达到协同治疗效应。此外,改良的传统的治疗方法如TACE和PEI可以将基因治疗的载体送入肝癌内部,从而增加有效剂量并尽可能减少非靶细胞的副作用。RNA干扰技术是研究功能基因组学最有前途的工具,目前被广泛的应用在基因研究和基因治疗中。如今,人们利用这种技术研究已知或可疑的因素在肿瘤形成中发挥的作用,来探索肿瘤形成过程中新的调节因子,从而为疾病的治疗提供新的选择。Eph(erythropoietin producing hepatoma cell line)家族是酪氨酸蛋白激酶受体中的最大亚族,参与了胚胎发育、细胞生长、组织塑形、神经系统信号传递等重要的生理过程。EphA7作为该家族的重要一员,定位于染色体6q16.1靠近断裂点的位置,其基因同源性较高且在人体内分布广泛。EphA7受体及其配体Ephrin结合后可形成双向信号传导,参与脊椎动物胚胎的早期发育和轴突导向等许多重要的生理过程,其在中枢神经系统发育、大脑连接处的形成、神经嵴细胞导向以及运动神经轴突形成过程中发挥着关键作用。以往对EphA7的研究多集中在生理方面,近几年来,其在肿瘤中所起的作用也被人们日益关注如在肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、多形性恶性胶质瘤等多种人类恶性肿瘤中均发现EphA7的异常表达。此外,有证据显示EphA7在肿瘤血管的形成、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中发挥着重要作用。但总的来说,对EphA7在肿瘤中的研究尚处于资料和认识的探索、积累阶段。目前,国内外有关EphA7在肝癌中的研究报道很少,仅做了初步筛查,未能形成系统性研究,且基于较少数量的临床标本,有可能会影响结果的可靠性,仍需进一步的研究加以证实。因此,对EphA7在人类原发性肝癌中表达的情况进行检测,并从基因水平探索其对肝癌细胞生物学行为的影响,对于了解EphA7在肝癌发生发展中的作用机制、指导临床工作具有重要的意义。本研究对EphA7在人类原发性肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达情况进行检测,并分析其与原发性肝细胞癌临床病理学因素之间的关系,对两者的相关性及临床意义作初步探讨。在此基础上,构建针对EphA7基因的siRNA真核表达载体并转染肝癌细胞SMMC-7721,观察RNA干扰抑制EphA7的表达对肝癌细胞SMMC-7721生长、增殖和侵袭等生物学行为的影响。然后将转染后的肝癌细胞在裸鼠中建立移植瘤模型,验证EphA7的下调对肝癌细胞在活体动物体内生长等的影响,奠定利用该基因治疗肝癌的实验基础,为了解EphA7在肝癌发生发展中的作用机制、靶向EphA7基因治疗肝癌提供理论依据。本研究分为以下四个部分：第一部分EphA7基因和蛋白在肝癌中的表达及临床意义目的观察EphA7基因和蛋白在原发性肝细胞癌中的表达,分析EphA7的表达与肝癌临床病理特征的关系并探讨其临床意义。方法收集40例肝癌组织及其相应的癌旁肝组织和10例正常肝脏组织标本。40例肝癌患者中男23例,女17例。年龄41-58岁,平均年龄48.3岁。Ⅰ-Ⅱ级16例,Ⅲ-Ⅳ级的24例。Ⅰ-Ⅱ期26例,Ⅲ期14例。分别采用RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫组织化学和Western blot方法检测上述标本中EphA7基因和蛋白的表达情况,并分析其于原发性肝癌临床病理因素的关系。结果1.40例肝癌组织及相应的癌旁肝组织和10例正常肝脏组织中均有EphA7基因的表达,其表达量分别为20.0711±32.0232、4.5184±9.4738和4.1764±4.7193(F=5.399,P<0.05)。统计分析显示肝癌组织中EphA7基因的表达量显著高于癌旁肝组织(P=0.015)和正常肝组织(P=0.013),而在旁癌肝组织和正常肝组织中EphA7基因的表达差异无统计学意义(P=0.998)。2. EphA7 mRNA的表达与肝癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期和甲胎蛋白水平等各项临床病理指标均无关(P>0.05),而与肿瘤的分化程度、门静脉癌栓和淋巴结转移有关(P<0.05)。分化程度低的肝癌患者EphA7 mRNA的表达明显高于分化程度高者(P=0.030),有门静脉癌栓的患者EphA7 mRNA表达明显高于无门静脉癌栓者(P=0.017),有淋巴结转移者EphA7 mRNA表达明显高于无淋巴结转移者(P=0.013)。3. EphA7蛋白的阳性表达主要定位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆,以及纤维间隔内血管壁的内皮细胞。其中肝癌细胞中EphA7蛋白的阳性表达较强,染色较深。癌旁肝组织及正常肝脏组织虽也可见到EphA7蛋白的阳性表达,但颜色普遍较浅。Western blot分析发现EphA7蛋白在肝癌组织、癌旁肝组织和正常组织中的表达量分别为0.5752±0.2590、0.4019±0.2234和0.3169±0.1594(P=7.826,P<0.05)。肝癌组织组织中EphA7蛋白的表达量显著高于癌旁肝组织(P=0.001)和正常肝组织(P=0.003),而在癌旁肝组织和正常肝组织中的其表达差异无统计学意义(P=0.309)。4.肝癌组织中EphA7蛋白的表达与肝癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期等临床病理指标均无关(P>0.05),而与肿瘤的分化程度、有门静脉癌栓、淋巴结转移和AFP水平有关(P<0.05)。分化程度低的肝癌患者EphA7蛋白的表达明显高于分化程度高者(P=0.001),有门静脉癌栓的患者EphA7蛋白的表达明显高于无门静脉癌栓者(P=0.008),有淋巴结转移者EphA7蛋白的表达明显高于无淋巴结转移者(P=0.033),AFP水平高者EphA7蛋白的表达显著高于AFP水平低者(P=0.013)结论EphA7不仅参与了正常肝脏细胞的生长发育过程,还与肝脏细胞的恶性转化密切相关。其可能在肝癌的恶性转化、侵袭和转移等生物学行为中发挥重要作用。第二部分pRNA-siEphA7干扰表达载体的构建与鉴定目的成功构建针对酪氨酸蛋白激酶受体EphA7基因的RNA干扰真核表达载体pRNA-siEphA7。方法根据Genbank上人类EphA7基因的核苷酸序列及siRNA的设计原则,选择3段序列：638-656nt、713-731nt和1456-1474nt作为干扰片段,所有寡核苷酸末端均加上与质粒载体pRNA-U6.1/Neo对应的酶切识别位点及转录终止子,人工合成针对EphA7的发夹样结构siRNA互补双链寡核苷酸。经过退火、质粒线性化以及体外重组等过程,构建抑制EphA7基因表达的干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3。将干扰载体转染入感受态大肠杆菌DH5α后进行克隆和筛选,PCR鉴定及基因测序验证干扰载体的准确性。结果1.新合成的正义及反义寡核苷酸,经退火处理形成双链互补结构。经DNA片段纯化及回收后,在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,在UVP凝胶成像分析仪上对照Marker进行验证,可见100bp附近的清晰条带,与设计的寡核苷酸大小118bp相吻合。2.以空载体pRNA-U6.1/Neo为对照,使用插入鉴定引物P1和P2进行PCR扩增筛选鉴定,得到310bp左右的扩增片段的阳性克隆,证明已经插入pRNA-U6.1/Neo载体。3.对3个重组质粒进行测序,结果证实插入的寡核苷酸序列正确,进一步证实重组质粒成功构建。结论构建了针对EphA7基因表达的干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3,经克隆、筛选及鉴定,证实其插入的寡核苷酸序列正确,进一步验证了其准确性并证实干扰载体pRNA-siEphA7构建成功。第三部分RNA干扰抑制EphA7基因表达对肝癌细胞株SMMC-7721生物学特性的影响目的观察转染干扰载体pRNA-siEphA7对肝癌细胞SMMC-7721的增殖活性、细胞周期以及体外侵袭能力等生物学行为的影响,筛选出抑制效果最强的干扰表达载体。方法以转染空载体和未转染的肝癌细胞SMMC-7721作为对照,将构建好的3组干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3转染至肝癌细胞SMMC-7721,通过G418筛选的方法建立稳定转染的肝癌细胞SMMC-7721/siEphA7。利用Real-time PCR和Western blot技术检测转染干扰载体前后肝癌细胞SMMC-7721中EphA7基因和蛋白的变化,MTT法测定转染干扰载体前后肝癌细胞SMMC-7721的增殖活性的改变,流式细胞技术分析转染干扰载体前后肝癌细胞SMMC-7721细胞周期的变化,Transwell小室侵袭实验检测转染干扰载体前后对肝癌细胞SMMC-7721体外侵袭能力的影响。结果1.通过荧光倒置显微镜,可发现转染干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3、转染空载体的肝癌细胞SMMC-7721中均可见清晰的绿色荧光,证明其转染成功。而未转染的肝癌细胞SMMC-7721则不见荧光。2.实时荧光定量PCR结果显示,转染干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3、转染空载体和未转染的的肝癌细胞SMMC-7721中EphA7基因的相对表达量分别为：0.1911±0.0153、0.1488±0.0199、0.0874±0.0123、0.4293±0.0533、0.4311±0.0410。经统计分析显示三组转染干扰载体的肝癌细胞中EphA7基因的表达明显低于空载体转染组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05),在三组转染干扰载体的肝癌细胞中,转染pRNA-siEphA7-3的肝癌细胞中EphA7基因的表达最低,与其他两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。转染pRNA-siEphA7-1和2的两组肝癌细胞中EphA7基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)。转染空载体和未转染载体的肝癌细胞中EphA7基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)3. Western blot结果显示转染干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3、转染空载体和未转染的的肝癌细胞SMMC-7721中EphA7蛋白的相对表达量分别为：0.2786±0.0392、0.3011±0.0372、0.2142±0.0147、0.5822±0.0291和0.5832±0.0154。三组转染干扰载体的肝癌细胞中EphA7蛋白的表达低于空载体转染组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。其中转染pRNA-siEphA7-3后对肝癌细胞中EphA7蛋白表达抑制最为明显,显著低于另外两个干扰载体转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。转染pRNA-siEphA7-1和2的两组肝癌细胞之间,以及转染空载体和未转染的肝癌细胞之间EphA7蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)4.经MTT法检测转染干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3、转染空载体及未转染的肝癌细胞SMMC-7721的体外增殖能力并绘制生长曲线,发现第1天各组之间细胞增殖速度无明显差异(P>0.05)。自第2天开始,转染干扰载体的三组肝癌细胞增殖速度明显低于空载体转染组和未转染组(P<0.05),但转染干扰载体的三组肝癌细胞之间增殖速度无明显差异(P>0.05)。自第3天开始,转染pRNA-siEphA7-3的肝癌细胞增殖速度开始低于转染干扰载体pRNA-siEphA7-1和2的肝癌细胞,并持续至第7天(P<0.05)。自第5天开始,转染干扰载体pRNA-siEphA7-1的肝癌细胞增殖速度开始低于转染pRNA-siEphA7-2的肝癌细胞,并持续至第7天(P<0.05)。而空载体转染组和未转染组的肝癌细胞之间增殖速度始终没有统计学差异(P>0.05)。5.流式细胞检测结果发现转染干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3、转染空载体和未转染载体的肝癌细胞SMMC-7721在G1期、G2期和S期的细胞分布比例基本相近,差异无统计学意义(P>0.05)。6.Transwell小室侵袭实验结果发现转染干扰载体pRNA-siEphA7-1、2和3的肝癌细胞SMMC-7721穿过人工基底膜的细胞分别是23.6±3.65、27±5.57和13.4±3.43.pRNA-siEphA7-3转染组的肝癌细胞穿膜细胞数明显低于pRNA-siEphA7-1和2转染组的穿膜细胞数,差异有统计学意义(P<0.05)。而pRNA-siEphA7-1和2转染组的肝癌细胞穿膜细胞计数无统计学差异(P>0.05)。转染干扰载体的三组肝癌细胞穿膜细胞计数明显低于空载体转染组(68.6±6.50)和未转染组(72±9.30),差异有统计学意义(P<0.05)。空载体转染组和未转染组相比,其穿膜细胞计数差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染干扰载体pRNA-siEphA7-1.2和3后,肝癌细胞SMMC-7721中EphA7基因及蛋白的表达明显受到抑制。EphA7的下调使肝癌细胞SMMC-7721的增殖活性明显降低、体外侵袭能力减弱,但细胞周期的变化不大。3组干扰载体中以pRNA-siEphA7-3(1456-1474nt)的干扰效果最好。第四部分RNA干扰抑制EphA7基因表达对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响目的通过建立裸鼠肝癌移植瘤模型,在活体动物体内观察siRNA阻断EphA7基因表达对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响。方法裸鼠荷瘤模型采用左上肢皮下注射肝癌细胞的方法建立。将32只裸鼠随机分为4组,每组8只,根据皮下注射细胞的不同分为以下几组：SMMC-7721组(注射肝癌细胞SMMC-7721)；SMMC-7721/siEphA7组(注射转染干扰载体pRNA-siEphA7-3的肝癌细胞SMMC-7721);SMMC-7721/Vector组(注射转染空载体的肝癌细胞SMMC-7721);PBS组(不注射细胞,仅注入PBS做对照)。移植瘤模型成功建立后5周以颈椎脱臼法处死裸鼠,观察并比较各组肝癌移植瘤的大小及重量,应用Real-time PCR、免疫组织化学技术以及Western blot检测荷瘤组织中EphA7基因和蛋白的表达情况。结果1.注射细胞约9-12天后,除PBS组外其余各组均可在注射部位的发现肝癌移植瘤的形成,证明肝癌细胞SMMC-7721、转染干扰载体以及空载体的肝癌细胞SMMC-7721在裸鼠体内均有成瘤活性,可成功建立裸鼠肝癌移植瘤模型。2.移植瘤模型建立后第35天,SMMC-7721组、SMMC-7721/siEphA7-3组和SMMC-7721/Vector组的移植瘤体积分别为2.19±1.18cm3、0.84±0.32cm3和2.33±0.97cm3,重量分别为1.78±0.58g、0.79±0.14g和1.83±0.72g。SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组的移植瘤体积和重量明显大于SMMC-7721/siEphA7-3组的移植瘤体积,差异有统计学意义(P<0.05),而SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组的移植瘤体积大小和重量差异无统计学意义(P>0.05)。转染干扰载体pRNA-siEphA7-3对裸鼠肝癌移植瘤的的抑瘤率为55%。3.实时荧光定量PCR结果显示SMMC-7721/siEphA7-3组、SMMC-7721/Vector组和SMMC-7721组的裸鼠移植瘤组织中EphA7基因的表达分别是0.191 1±0.0204、0.3900±0.0863和0.4219±0.0595。SMMC-7721/siEphA7-3组中EphA7基因的表达明显低于SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组,差异有统计学意义(P<0.05),而SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组之间EphA7基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)4.免疫组化分析结果显示SMMC-7721/siEphA7-3组EphA7蛋白阳性染色的细胞较少,染色较浅,呈浅黄色。而SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组的EphA7蛋白阳性染色细胞较多,染色较深,呈棕黄色。Western blot分析显示,SMMC-7721/siEphA7-3组、SMMC-7721/Vector组和SMMC-7721组的裸鼠移植瘤组织中EphA7蛋白的表达分别是0.2044±0.0153、0.4582±0.0631和0.4816±0.0607,SMMC-7721/siEphA7-3组中EphA7蛋白的表达明显低于SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组,差异有统计学意义(P<0.05),而SMMC-7721组和SMMC-7721/Vector组之间EphA7蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)结论利用siRNA抑制肝癌细胞SMMC-7721中EphA7的表达,可减缓肝癌细胞SMMC-7721在活体动物体内的生长。