宫颈癌[cervical cancer，CC]在妇科恶性肿瘤中是十分常见的。近些年来，伴随着对宫颈癌各县市筛查工作的普及和对宫颈高级别上皮内病变的积极干预治疗，已经使现今宫颈癌的发病率呈现下降趋势。但在部分国家和地区宫颈癌的发生率仍然维持在很高的水平。而且宫颈癌是女性高度恶性的肿瘤之一，死亡率较高，对广大妇女的健康造成很大的威胁。目前研究认为，宫颈癌发病的必须因素是感染高危人乳头瘤病毒[High Risk Human papilloma virus,HR-HPV]，持续高危HPV感染是导致富颈上皮细胞发生癌变的主要原因，并在宫颈癌的发展过程中出现一系列异常的细胞生物学改变，但也有些学者认为高危HPV感染并不是导致宫颈癌的唯一发病因素。其中病毒的宿主因素也制约了疾病的发生和发展。因此，为了制定宫颈癌防控新策略，我们有必要了解这些病毒的宿主因素在宫颈癌的发生和进展过程中是怎样的作用与机制，这对做好宫颈癌的防治工作具有重要的意义。　　microRNAs(miRNAs)可以引起靶基因mRNA降解或翻译抑制，它是一种具有靶向调控功能的非编码内源性小分子单链RNA，与靶基因mRNA3-UTR结合是它的作用机制，可以在转录后水平改变基因的表达。多种肿瘤的发生及发展过程中miRNAs存在表达异常已经在很多研究中得以证明，mcroiRNAs发挥的生物学功能和作用机制在不同的组织以及不同的细胞中不完全相同，它发挥生物学作用方式所具有的特点是组织与细胞特异性。此外，多个不同的miRNA也可以同时作用于一个靶基因，同一个miRNA可以有多个不同的靶基因，这些原因造成了miRNA可以具有不同的生物学功能，因此，miRNA及其靶分子可以形成巨大、关系错综复杂的生物调控网络。可以肯定，miRNAs在肿瘤的发生发展过程中发挥了非常重要的作用。在宫颈癌恶性肿瘤中，至今已发现多种miRNA表达呈下降或升高趋势，其参与宫颈癌的发生、侵袭、转移等生物学过程，调控宫颈癌细胞的生物学行为可以通过不同的靶基因进行。因此，研究探索宫颈恶性肿瘤防治新策略中microRNA在宫颈鳞癌的发生发展中的作用及机制有重要意义。　　前期工作中，我们在宫颈癌标本中已初步证实了Smad4的表达与宫颈癌患者的肿瘤分期、肿瘤转移及预后相关，因此Smad4是研究宫颈癌恶性生物学行为的一个“潜在”的重要靶点。但在宫颈癌中Smad4发挥影响肿瘤分子机制的原因尚不清楚。在本研究部分中我们将采用生物信息学数据库，预测Samd4的调控miRNAs的交集为miR-205，我们进一步比较分析了宫颈癌临床病理因素与miR-205的表达水平的相关性。并应用基因功能相关实验，研究宫颈癌异常的细胞生物学行为中miR-205的异常表达情况及影响，并确定其发挥作用的靶基因及发挥生物学作用的机制。在为防控宫颈癌发生与进展探寻新机制提供科学依据及策略。　　第一部分 miR-205在宫颈癌组织中的表达及与宫颈癌临床病理因素关系的分析　　目的:　　确定Smad4的靶基因，并探讨miR-205表达与宫颈癌临床病理因素之间的相关性。　　方法:　　利用生物信息学软件预测Smad4靶基因，收集宫颈鳞癌150例、培养宫颈癌细胞株ME-180、Hela、CaSki、MS751、SiHa、C-33A及正常宫颈细胞Ect1/E6E7。采用PCR法检测miR-205表达水平。应用荧光素酶报告实验检测miR-205与Smad4mRNA的结合情况，并收集宫颈癌患者的临床病理资料，分析miR-205的表达水平与宫颈癌临床病理因素的相关性。　　结果:　　1.数据库预测显示调控Smad4相关miRNAs的交集为miR-205。　　2.在ME-180、Hela、CaSki、MS751、SiHa、C-33A宫颈癌细胞株中，miR-205的表达为5.55、7.66、10.25、5.32、6.44、5.70，较正常宫颈细胞株中的表达(1.41)均显著升高，其中miR-205在SiHa细胞中的表达最高。　　3.Smad4mRNA在ME-180、Hela、CaSki、MS751、SiHa、C-33A宫颈癌细胞株中的表达分别为1109.74、1538.06、265.88、2574.97、1481.03、1462.83、，较正常宫颈细胞株中的表达(2810.72)均显著降低，其中SiHa细胞中的表达最低。　　4.荧光素酶报告实验显示miR-205组与对照组相比，荧光素酶活性显著降低。　　5.150例宫颈癌组织检测显示，miR-205的表达水平(1.366±0.054)显著高于宫颈正常上皮组织(0.286±0.015)。　　6.在75例miR-205低表达组中，Smad4蛋白表达阳性60例，75例miR-205高表达组中，Smad4蛋白表达阳性9例，Smad4蛋白与miR-205表达之间存在显著的负相关关系。　　7.miR-205高表达与高的宫颈癌FIGO分期、淋巴结阳性、深间质浸润、阴道壁累及以及脉管间隙阳性呈显著相关。　　结论:　　我们利用生物信息学预测出miR-205与Smad4的可能相互作用，荧光素酶报告系统系统证实了miR-205与Smad4的直接相互作用关系，而且在细胞株中和宫颈癌组织中验证了miR-205与Smad4的表达呈现负相关的关系，而且通过对宫颈癌临床病理因素的分析发现miR-205可能在宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移中扮演了重要角色。　　第二部分 miR-205对宫颈癌细胞生物学行为的影响　　目的:　　明确miR-205调控宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的作用。　　方法:　　在下调miR-205宫颈癌细胞系SiHa中利用MTT法进行细胞增殖能力的检测，同时应用流式细胞技术进行细胞凋亡的检测，最后应用Transwell侵袭实验进行细胞侵袭能力的检测。　　结果:　　1.SiHa细胞在转染miR-205inhibitor72h后细胞增殖能力降低，抑制率约为36.1％，与阴性对照组及空白对照组比，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　2.SiHa细胞在转染miR-205inhibitor72h后，细胞凋亡率从3.18±0.51％增加到8.48±0.62％，与阴性对照组及空白对照组比，差异有统计学意义(P＜0.001)。　　3.SiHa细胞在转染miR-205inhibitor72h后，肿瘤细胞发生转移的数目(158.31±22.15)显著低于阴性对照组(301.24±19.40)及空白对照组(326.79±30.25)，差异有统计学意义(P＜0.001)。　　结论:　　下调miR-205的表达能够显著抑制宫颈癌细胞增殖，并促进凋亡、减弱肿瘤细胞的侵袭能力。　　第三部分 miR-205调控Smad4对宫颈癌生物学行为的影响的机制研究　　目的:　　揭示miR-205促宫颈癌发生过程中的分子机制。　　方法:　　自SiHa细胞株中在降低miR-205表达的基础上应用慢病毒干扰技术同时降低Smad4的表达，利用MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞技术检测细胞的凋亡，Transwell检测细胞侵袭能力变化。应用Westernblot的方法检测TGF-β、MMP、Bcl-2蛋白表达。　　结果:　　1在SiHa细胞株中在抑制miR-205的基础上下调Smad4的表达后，与单纯抑制miR-205相比，细胞增殖能力增强。　　2在SiHa细胞株中在抑制miR-205的基础上下调Smad4的表达后，与单纯抑制miR-205相比，细胞凋亡率由显著降，两组凋亡数分别为(7.93±0.23)和(2.92±0.24)。　　3在SiHa细胞株中在抑制miR-205的基础上下调Smad4的表达后，与单纯抑制miR-205相比，细胞侵袭数目由(164.03±22.23)显著增强至(315.31±14.17)。　　4与对照组相比miR-205抑制后，Smad4表达显著增加，TGF-β、Bcl-2和MMP-2的表达均显著降低，而在miR-205抑制的基础上降低Smad4的表达，TGF-β、Bcl-2和MMP-2的表达水平恢复。　　结论:　　miR-205通过调控Smad4发挥生物学作用，miR-205调控宫颈癌生物学行为与TGF-β、Bcl-2和MMP-2的表达有关。