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家蚕素（bombyxin,Bbx）是无脊椎动物中首个被鉴定的昆虫胰岛素，分子量5KD，家蚕素Ⅱ的蛋白氨基酸组成与人类胰岛素具有高度同源性。在昆虫体内，家蚕素具有调节变态发育、参与糖代谢调控，促进造血器官细胞增殖以及卵巢发育等生理功能，本课题组前期应用基因工程重组技术合成家蚕素Ⅱ基因，并构建了重组家蚕素Ⅱ真核表达载体，在293FT细胞内实现瞬时表达家蚕素Ⅱ蛋白，通过表达重组家蚕素Ⅱ蛋白作用于肝癌细胞株HepG2细胞，初步确定家蚕素Ⅱ对哺乳细胞具有一定的胰岛素样作用。本研究在上述研究基础上，将以两种胰岛素作用的靶细胞——肝癌细胞株HepG2细胞及前脂肪细胞株3T3-L1细胞为研究对象，应用基因转染的方法使重组家蚕素蛋白稳定在靶细胞内表达，并持续发挥相关生物学作用。在此基础上（1）进一步验证重组家蚕素Ⅱ对于哺乳细胞的胰岛素样作用。（2）探讨重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞胰岛素样作用的相关通路。（3）探讨重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞胰岛素样作用相关通路中分子蛋白表达的影响。进一步阐述重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞胰岛素样作用以及相关机制，从而为以家蚕素为对象进行新型口服抗糖尿病药物开发奠定实验与理论基础。本研究得出结果如下：（1）重组家蚕素Ⅱ基因在HepG2细胞与3T3-L1细胞内获得稳定表达应用脂质体介导的基因转移技术将重组家蚕素Ⅱ基因质粒载体分别导入HepG2细胞与3T3-L1细胞内，并进行基因稳定表达细胞的筛选。分别应用RT-PCR技术、免疫细胞化学技术与Western blot技术检测重组家蚕素Ⅱ在细胞内的表达。实验结果显示两种细胞经G418筛选获得细胞克隆，并能传代扩增。RT-PCR检测结果显示可从转染重组家蚕素Ⅱ基因的两种细胞中扩增出重组家蚕素Ⅱ基因检测基因片段，而未转染基因以及对照质粒转染的两种细胞不能扩增出重组家蚕素Ⅱ基因检测基因片段；免疫细胞化学结果显示在转染重组家蚕素Ⅱ基因的两种细胞胞浆内可见棕黄色颗粒，而未转染基因以及对照质粒转染的两种细胞内未见棕黄色颗粒；Western blot结果显示转染重组家蚕素Ⅱ基因的两种细胞的上清和细胞内，均可以见到明显的蛋白条带，大小为5KD左右。上述结果表明重组家蚕素Ⅱ基因在HepG2细胞与3T3-L1细胞内的获得稳定表达。为进一步研究重组家蚕素Ⅱ基因对两种哺乳细胞胰岛素样作用奠定实验基础。（2）进一步阐述重组家蚕素Ⅱ对HepG2细胞与3T3-L1细胞胰岛素样作用应用MTT方法检测细胞增殖曲线，流式细胞术检测细胞周期，用以判定重组家蚕素Ⅱ对两种细胞增殖能力的影响。应用葡萄糖摄取实验，糖原合成实验判定重组家蚕素Ⅱ对两种细胞糖代谢能力的影响。实验结果显示重组家蚕素Ⅱ能够促进HepG2细胞与3T3-L1细胞的增殖，提高两种细胞周期中G2+S期细胞的数目。重组家蚕素Ⅱ基因可提高HepG2细胞与3T3-L1细胞的葡萄糖摄取能力，以及HepG2细胞糖原合成能力。上述结果从促进细胞增殖与调节糖代谢两个方面证明了重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞具有胰岛素样作用，为下一步研究其胰岛素样作用相关分子机制提供理论基础。（3）阐述了重组家蚕素Ⅱ可通过PI3K以及MAPK通路发挥胰岛素样作用通过给予PI3K以及MAPK抑制剂后检测细胞的增殖能力、葡萄糖消耗实验以及糖原合成能力，观察重组家蚕素Ⅱ是否通过上述两种通路发挥胰岛素样作用。实验结果显示在与未给予PI3K抑制剂的重组家蚕素Ⅱ基因转染HepG2细胞及3T3-L1细胞相比，给予PI3K抑制剂后两种细胞的葡萄糖摄取以及HepG2细胞糖原合成能力下降，说明重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞的糖代谢作用可被PI3K抑制剂所阻断。与未给予MAPK抑制剂的重组家蚕素Ⅱ基因转染的3T3-L1细胞相比，给予MAPK抑制剂后细胞增殖能力明显下降。说明重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞的增殖作用可被MAPK抑制剂所阻断。上述结果说明了重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞可能通过PI3K以及MAPK通路发挥胰岛素样作用。（4）阐述了重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞PI3K以及MAPK通路相关分子磷酸化水平的影响，对重组家蚕素Ⅱ胰岛素样作用的分子机制进行探讨应用Western Blot方法检测各组HepG2细胞PI3K通路上AKT、GSK-3β及FoxO-1分子蛋白磷酸化水平，结果显示，转染重组家蚕素Ⅱ基因的HepG2细胞AKT、GSK-3β蛋白磷酸化水平明显高于未转染重组家蚕素Ⅱ基因的HepG2细胞，而FoxO-1分子蛋白磷酸化水平低于未转染重组家蚕素Ⅱ基因的HepG2细胞。应用Western Blot方法检测各组3T3-L1细胞PI3K通路上AKT以及FoxO-1蛋白磷酸化水平，结果显示，转染重组家蚕素Ⅱ基因的3T3-L1细胞的AKT、FoxO-1蛋白磷酸化水平明显高于未转染重组家蚕素Ⅱ基因的细胞。胰岛素能够提高HepG2细胞与3T3-L1细胞PI3K通路上AKT、GSK-3β及FoxO-1分子蛋白磷酸化水平。Western Blot方法检测各组3T3-L1细胞MAPK通路MEK及ERK分子蛋白磷酸化水平，结果显示转染重组家蚕素Ⅱ基因的3T3-L1细胞的MEK及ERK分子蛋白磷酸化水平明显高于未转染重组家蚕素Ⅱ基因的细胞。上述结果说明重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞PI3K以及MAPK通路相关分子蛋白磷酸化水平具有一定影响，从而发挥胰岛素样作用，但在对某些蛋白分子磷酸化水平影响与胰岛素也存在不同，提示该蛋白可能具有某些与胰岛素不同的生物学功能。本研究创新点在于通过在HepG2及3T3-L1细胞稳定表达重组家蚕素Ⅱ基因，进一步阐述了重组家蚕素Ⅱ具有调节哺乳细胞糖代谢与细胞增殖两方面的胰岛素样作用，在此基础上，证实了重组家蚕素Ⅱ针对哺乳细胞具有胰岛素样作用是分别通过PI3K-AKT-GSK-3β及MAPK-MEK-ERK途径发挥作用的。为开发胰岛素类似物的抗糖尿病口服药物奠定了实验和理论基础。