哺乳动物基因组转录合成大量的非编码RNA,其中大多数为功能未知的调节性RNA，主要包括两类：microRNA(miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)。miRNA发挥功能的分子机制已比较清楚，即通过种子序列与靶mRNA分子3’UTR不完全互补结合，从而降解mRNA或抑制其翻译。目前的大量研究成果已经证明miRNA在很多生理和病理环境下发挥着重要的调控作用。近几年，miRNA在免疫细胞发育和免疫应答调控中的作用得到了深入研究。天然免疫应答是机体对抗入侵的病原体的第一线，主要由天然免疫细胞实现，包括单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）、粒细胞和NK细胞。现已证实miRNA在天然免疫反应中发挥着不可或缺的作用，参与调控单核细胞/巨噬细胞、DC和粒细胞的分化发育，并调控这些天然免疫细胞对病原微生物、TLR配体刺激和病毒感染的免疫应答反应。但NK细胞中miRNA的功能目前尚不清楚。在二代测序技术广泛应用之后lncRNA的研究逐渐受到学术界的关注。目前已发现lncRNA在生物学许多领域中发挥着重要的作用，如干细胞生物学、个体发育、X染色体失活、神经科学和癌症。然而，总体而言，发现功能的lncRNA还是少数，依然还有大量功能未知的lncRNA。在免疫系统中，lncRNA的表达谱仅在T细胞中有过报道分析，有功能报道的lncRNA分子则更少。在确定lncRNA的功能之后，另一个重要命题是研究其分子功能机制。与miRNA明确的分子机制相比， lncRNA的作用模式多样，且难以预测。目前研究已报道的lncRNA分子作用机制可以概括为两类：一是在细胞核内通过结合调节染色质修饰和表观遗传修饰的酶或蛋白复合体调控基因的转录；二是在细胞浆中通过结合STAU1或者竞争性结合miRNA等影响mRNA的稳定性或蛋白翻译。当然，lncRNA的作用模式远不限于此，每一次有报道发现新的lncRNA的作用模式，都会引起较高的学术关注。lncRNA新的作用模式有待于在不断深入研究中进一步被发现。NK细胞是一群独特的天然免疫细胞，其通过类似于获得性免疫T细胞配体受体相互识别的方式杀伤被病毒感染的细胞或转化的细胞。NK细胞通过多种机制介导其细胞杀伤功能，包括穿孔素/颗粒酶颗粒B的胞外释放和活化TNF受体信号等。基因改造小鼠实验和人群遗传缺陷研究已证实，穿孔素和颗粒酶B对NK细胞的细胞杀伤功能是至关重要的，颗粒酶B可以介导NK细胞对靶细胞的凋亡作用。在免疫应答反应中，NK细胞的细胞杀伤能力可以被很多活化性细胞因子增强，即活化NK细胞。I型干扰素对于人和小鼠的NK细胞都是最有力的活化因子之一，然而其中的活化机制并不十分清楚。有研究认为I型干扰素可以刺激淋巴组织中的DC细胞产生IL-15从而间接活化NK细胞，而有实验表明NK细胞中的I型干扰素信号能直接诱导颗粒酶素B和穿孔素的表达上调且是清除牛痘病毒感染所必需的。因此，I型干扰素可能通过直接和间接的方式活化NK细胞，然而具体分子机理尚不清楚。已有报道I型干扰素可以调节巨噬细胞中miRNA的表达从而介导对巨噬细胞功能的调控，由此我们猜想I型干扰素是否能调节miRNA在NK细胞中的表达从而影响NK细胞功能。在哺乳动物的免疫系统中，树突状细胞（DC）是功能最强大的抗原呈递细胞，其成熟和功能的状态决定着后续免疫反应的结果。一般在机体免疫应答过程中，DC感受到病原微生物刺激后，分泌大量细胞因子包括IL-12、IL-10等，从而对其他免疫细胞产生调控作用，同时自身高表达抗原递呈相关分子及共刺激分子，如MHC(HLA)、CD80、CD86、CD40等，从而更加有效地加工递呈抗原，活化T细胞，触发获得性免疫应答。DC在天然免疫和获得性免疫之间发挥着重要的中枢桥梁作用，因此其成熟和功能状态也是免疫学研究的热点。对于非编码RNA而言，miRNA在DC分化成熟中的差异表达谱及功能已有不少研究报道，而lncRNA在DC中的表达谱和功能还是空白。T细胞的各个亚群有着自己独特的专一的转录因子控制其分化和功能，DC细胞中，到目前为至，还没有发现一个在DC中特异性表达且对DC的分化和功能起到关键调控作用的生物分子。尽管之前的研究证实几个转录因子在DC的分化和发育中起到重要作用，如STAT3和PU.1，但都不是DC专有的重要分子。近来的研究逐渐发现lncRNA能够对基因组层面的转录产生影响从而影响细胞的各方面的性质和功能，如体细胞分化发育、肿瘤细胞恶性转换和转移。在DC细胞中同样表达大量的lncRNA，因此，我们设想从lncRNA的层面寻找这样一个在DC分化和功能中发挥重要作用的RNA分子。基于以上研究背景和课题设想，本课题分为两个部分。一、miRNA在人NK细胞活化和功能中的作用及其机制研究为了研究miRNA在人NK细胞活化和功能中的作用，我们用IFNα活化人外周血PBMC分离的NK细胞，对其中3个时间点（0小时，12小时和24小时）的small RNA组分进行高通量测序检测，得到了IFNα活化过程中人NK细胞miRNA表达谱。通过生物信息学分析和预测，我们发现miRNA总体变化不大基本稳定，仅有小部分miRNA在活化后表达下降，且很可能参与了NK细胞杀伤功能的上调中。我们在NK细胞中表达量最高的12个miRNA中发现了两个miRNA，miR-378和miR-30e，其在IFNα活化后显著下调。且在人NK细胞检测结果中发现两者表达量与NK细胞中的杀伤分子颗粒酶B和穿孔素的表达分别成负相关关系，提示miR-378和miR-30e可能在人NK细胞中参与调控杀伤分子的表达。通过TargetScan（www.targetscan.org）的靶分子预测，我们发现miR-378和miR-30e分别在人GZMB（颗粒酶B）和PRF1（穿孔素）基因的3’UTR有靶向结合位点。GZMB和PRF1的3’UTR荧光报告基因以及结合位点突变报告基因实验证实miR-378和miR-30e确实能够通过3’UTR靶位点分别抑制GZMB和PRF1基因的表达。接下来，我们研究了miR-378和miR-30e能否在人NK细胞内抑制杀伤分子的表达。流式细胞检测和western blot的结果证实，NK细胞转染miR-378mimic后能够抑制其颗粒酶B的表达，而转染miR-30mimic能够抑制NK细胞中穿孔素的表达。尤其在IFNα活化的NK细胞中，miR-378mimic和miR-30mimic在很大程度上拮抗了IFNα对颗粒酶B和穿孔素表达的上调作用。这些结果表明miR-378和miR-30e参与了IFNα对NK细胞杀伤功能的调控。通过降低miR-378和miR-30e从而增强细胞毒分子的表达是IFNα活化NK细胞所特有的机制，还是NK细胞活化过程中的一个普遍机制？为了回答这个问题，我们采用了多种活化性的细胞因子，IL-15、IL-12和IL-2，来刺激NK细胞。我们定量PCR检测发现miR-378和miR-30e的表达在刺激后都有不同程度的下降，流式细胞检测和免疫印迹结果证实杀伤分子颗粒酶B和穿孔素的表达提高了，且两两之间的变化趋势成负相关。如，IL-15刺激NK细胞后颗粒酶B和穿孔素的表达上升最显着，对应的，miR-378和miR-30e的降低是最显著。为了研究NK细胞在体内活化的情况，我们新鲜分离了人外周血中活化的NK细胞亚群（CD16+CD56dimCD3-CD69+）和静息的NK细胞亚群（CD16+CD56dimCD3-CD69-），发现miR-378和miR-30e的表达在活化的NK细胞中明显降低，同时伴随着细胞杀伤分子的上升。这说明miR378/miR-30e和杀伤分子之间的负相调控关系也存在于体内的NK细胞的活化过程，从而进一步证实了在体内NK细胞中miR-378和miR-30e能负相调控颗粒酶B和穿孔素的表达。最后，为了确认miR-378和miR-30e对NK细胞杀伤功能的调控作用，我们用miR-378sponge和miR-30sponge的miRNA抑制性载体稳定转染了人NK细胞系NK92。流式检测证实颗粒酶B在miR378sponge稳转细胞明显增加，而穿孔素在miR-30e sponge稳转细胞中的表达也明显上升。在细胞杀伤活性方面，miR-378sponge和miR-30e sponge稳转细胞与对照组的NK92细胞相比，显示出更强的杀伤活性。综上所述，我们证明了miR-378和miR-30e通过靶向抑制细胞毒性分子颗粒酶B和穿孔素的表达从而抑制NK细胞的杀伤功能，在NK细胞活化时通过降低miR-378和miR-30e的表达增强NK细胞杀伤功能。这项工作从miRNA层面提出了NK细胞功能调控的新模式，同时miR-378和miR-30e作为杀伤分子和NK细胞的调控分子可能在临床相关疾病中有所应用。二、长链非编码RNA(lncRNA)在人树突状细胞成熟和功能中的作用及其机制研究为了研究lncRNA在人DC中的功能，我们利用lncRNA基因芯片检测了外周血单核细胞分化而来的DC以及脂多糖（LPS）诱导的成熟DC中lncRNA的表达谱，发现了76个lncRNA的表达在DC分化成熟过程中有显著变化（>20倍）。在成熟DC中表达上调最明显的一个lncRNA,定位于17号染色体的基因间（linc-RNA），我们将其命名为linc-DC。反义RNA干扰结果发现，linc-DC被抑制后成熟DC表面抗原递呈分子及共刺激分子的表达下降，细胞因子IL12的分泌减少，表现出未成熟的特征。在功能上，DC活化T细胞的功能受损，表现为混合淋巴细胞实验中（MLR）成熟DC刺激同种异体CD4+T细胞的增殖和活化的能力减弱。这表明linc-DC对DC的成熟和功能是必需的。通过检查linc-DC在人类其他免疫细胞中的表达水平，我们发现linc-DC在成熟DC中特异的高表达，这表明linc-DC很可能是DC特异的功能调控分子。是什么机制决定了linc-DC在成熟DC中特异性的高表达呢？首先，利用RACE我们确定了linc-DC在人DC中的转录起始位点（TSS）和终止位点，并克隆得到了其全长序列（417nt），并证实其确实没有蛋白编码的能力。利用ChIP-qPCR我们在人单核细胞、未成熟DC和成熟DC中检测了linc-DC基因区域的9个位点的组蛋白修饰，发现H3K4me3和H3K27ac在从单核细胞到DC成熟过程中明显增强。而且，染色质的可接近性实验证明在human DC分化成熟过程中linc-DC基因区域的染色质结构逐渐松动或打开，从而促进了linc-DC的转录。作为对照，单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）活化过程中linc-DC基因区域没有发现如上变化。同时，我们发现转录因子PU.1在linc-DC启动子区域有特异结合位点，ChIP-qPCR和启动子报告基因实验证实PU.1的结合促进了linc-DC的转录。基于以上结果，我们认为在DC分化成熟过程中linc-DC基因区域逐渐形成一种开放的易于接近的染色质结构和有利于转录的组蛋白修饰，从而促进了转录因子PU.1的结合，在成熟DC中表达产生linc-DC。接下来，我们对linc-DC促进DC成熟的分子机制进行了研究。RNA FISH和细胞核质分离RT-PCR证实linc-DC是一个定位于胞浆中的RNA分子。通过RIP RNA蛋白相互结合实验和生物信息学分析我们发现linc-DC并不是通过之前报的模式发挥作用。于是我们利用生物素标记的linc-DC对人DC细胞浆组分进行RNA pull-down，拉下来的组分进行凝胶分离和蛋白质谱鉴定。发现STAT3分子，一个在免疫和肿瘤中介导多种重要信号的信号转导分子，是linc-DC的结合蛋白，免疫印迹证实了质谱的结果。RIP实验进一步验证了STAT3能够结合linc-DC。而共聚焦显微镜证实两者在humanDC细胞质中的共定位关系。STAT3并非RNA结合蛋白，为了证明其能够直接结合linc-DC，我们采用了PAR-CLIP的方法，一种改进的紫外介导的铰链RIP实验，结果证实linc-DC确实能够直接结合STAT3。而各种截短的linc-DC RNA进行pull-down实验证实，linc-DC的3’端序列（265-417nt）就可以结合STAT3。RNA二级结构预测发现此段序列（265-417nt）存在一组稳定的发卡结构，这可能是其结合STAT3的结构基础。在linc-DC RNA pull-down和STAT3RIP实验中通过比较未成熟和成熟DC样品，我们发现STAT3和linc-DC的结合在DC成熟过程中逐渐增强。随后，deletion-mapping实验证实STAT3羧基端结构（583-770氨基酸, C-terminus）是linc-DC的结合位点。由于这一结构域中包含STAT3的磷酸化位点（Tyr705），我们猜测linc-DC的结合可能影响了STAT3磷酸化状态进而影响STAT3信号。Westernblot表明在人DC中STAT3Y705磷酸化在linc-DC knockdown后下降，同时下降的还有STAT3的入核，而linc-DC高表达促进了STAT3的磷酸化及STAT3报告基因。这可能是因为linc-DC和STAT3的结合影响了STAT3与其它蛋白激酶或磷酸酶的相互作用，从而影响了STAT3的磷酸化或去磷酸化。因此，我们通过免疫沉淀（IP）STAT3研究了linc-DC存在与否对STAT3相互作用蛋白谱的影响，差异条带的质谱鉴定结果提示酪氨酸磷酸酶SHP1参与其中。后续的co-IP western blot证实，linc-DC干扰后能够促进SHP1与STAT3在成熟和未成熟DC中的结合，而linc-DC高表达则能减弱他们的相互结合。体外磷酸酶实验证明，linc-DC RNA能够保护STAT3免于重组人SHP1的去磷酸化作用，而对照反义互补的RNA则没有这个作用。最后，为了证明STAT3信号在人DC的成熟和功能中的关键作用，我们用了两种化学合成的STAT3抑制剂，S3I-201和Stattic。证实，与linc-DC抑制实验的结果类似，STAT3抑制剂明显抑制了人DC成熟和功能。因此，我们的数据证明linc-DC通过增强STAT3信号促进DC的成熟和功能。在部分的研究中，我们确定了一个DC特异性表达的lncRNA，linc-DC，其对DC的成熟和功能是必不可少的。PU.1介导的linc-DC在成熟DC中的表达，并依赖于linc-DC基因位点H3K4me3和H3K27ac的组蛋白修饰和开放的染色质结构。这些发现加深了对DC作为一个细胞群体的认识。Linc-DC通过直接结合STAT3磷酸化位点Tyr705附近结构区域阻碍了SHP1介导的去磷酸化作用，从而增强了STAT3信号。这项研究为lncRNA胞浆内作用提出了新模式，即lncRNA分子可以通过直接结合信号转导分子，调节其翻译后修饰，如磷酸化，从而实现对细胞功能的影响。胞浆中的其他lncRNA是否也可能通过与linc-DC类似的方式实现其功能？在细胞中还有多少其他信号转导通路或信号转导分子直接受lncRNA分子的调控？这些问题都有待进一步的研究证实。此外，内源性的非编码RNA，linc-DC，作为DC功能和STAT3信号的一个调控分子，可能应用于DC功能障碍或STAT3异常活化相关临床疾病的诊断检测和治疗中，或者应用于临床过继回输更有效DC疫苗的免疫治疗中。总之，通过以上两部分的实验。我们研究了非编码RNA在免疫细胞活化和功能中的重要作用，形成了一整套RNA研究的技术体系，为今后的进一步研究打下了基础。我们分别在human NK细胞和DC中发现了具有重要功能调控作用的非编码RNA，拓展和加深了非编码RNA在免疫中的研究，并具有潜在的临床应用价值。同时我们的研究对lncRNA的作用模式和胞内信号传导调控提出了新的认识，阐明了RNA分子可以直接调控信号转导分子的新模式。