研究目的组织工程技术为临床骨缺损的治疗提供了新的途径,应用组织工程技术在小型哺乳动物体内构建骨组织,修复中、小尺寸的骨缺损的方法已基本成熟。但是对于大型哺乳动物大范围或受区血供不佳的骨缺损,由于移植物早期没有独立的血液供应,营养渗透不足,骨痂形成缓慢、成骨效果不稳定。如何建立有效的血液供应,促进组织工程骨形成,缩短骨愈合时间是目前骨组织工程的研究重点,也是制约组织工程骨大规模临床应用的关键。为此,我们参考临床常用的带血管蒂的腓骨移植术式,在比格犬体内进行带血管蒂的组织工程骨构建及修复骨缺损的研究；采用多种方法进行血管化检测；并应用CT进行长期成骨量化评价,对成骨过程中相关因素展开深入探讨,为应用显微外科技术进行带血管蒂的组织工程骨移植奠定大动物实验基础。研究方法1.体外构建细胞支架复合物：髂骨穿刺抽取比格犬骨髓,应用Ficoll-Paque Plus液通过密度梯度离心分离BMSCs,扩增、成骨诱导培养BMSCs两周,经碱性磷酸酶、茜素红、骨钙素、骨桥蛋白染色确认表达成骨细胞相关蛋白后,将诱导的BMSCs接种于带凹槽的珊瑚-羟基磷灰石支架继续体外培养一周,应用激光共聚焦显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上生长情况。2.体内构建含隐动静脉的组织工程骨,修复腓骨缺损：将细胞支架复合物植入比格犬下肢肌间隙,使隐动静脉血管嵌入支架的凹槽中,4周后应用B超、CT血管造影、血管铸型和组织学染色观察血管化情况,应用组织工程复合物修复腓骨标准骨缺损。组织工程复合物共分4组：VSC组(带血管蒂的细胞支架)、SC组(细胞支架)、VS组(带血管蒂的空白支架)、S组(空白支架),移植后1、3、6、9月应用CT和组织学方法分别评估在异位成骨环境(肌间隙)和骨缺损环境(腓骨缺损)组织工程骨形成及支架降解情况。3.系统分析细胞、血管、微环境因素对组织工程骨形成和支架降解的影响：由于CT值与骨组织密度近似线性关系,能够较精确反映骨骼的骨量信息,我们用相对CT值代表新生的组织工程骨量,即VSC组平均CT值与VS组平均CT值相减所得值为VSC组相对CT值；SC组平均CT值与S组平均CT值相减所得值为SC组相对CT值,不同时间点的相对CT值相减即为阶段成骨量。应用VS组和S组平均CT值评估支架降情况,不同时间点的平均CT值相减即为支架阶段降解量。将四组支架在不同成骨环境下各时间点的CT值进行统计比较,分析细胞、血管、微环境因素对组织工程骨形成和支架降解的影响。数据以均数±标准误表示,采用spss17.0软件进行统计处理,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.BMSCs-CHA复合物体外构建：BMSCs在体外成骨诱导培养后可迅速增殖、分化,成骨诱导的第二代BMSCs高表达成骨细胞相关标志物(碱性磷酸酶、茜素红、骨钙素、骨桥蛋白),接种CHA支架后贴壁生长良好,迅速增殖并产生大量细胞外基质。2.BMSCs-CHA复合物血管化检测：首次应用B超、CT、血管铸型、组织学染色证实VSC组移植到下肢肌间隙内四周后可形成含隐动静脉的脉管网络系统,可进行带血管蒂移植。3.异位成骨环境成骨情况：组织学显示VSC组3月后可见少量骨样组织形成,6月后骨组织增多,9月后可见大量成熟骨组织,残存少量支架。SC组3月后可见类骨质样结构,未见明显骨组织；6月可见类骨质成熟形成骨组织,9个月可见骨组织进一步增多,支架残余较多。VS组和S组支架孔隙中填充纤维结缔组织,支架表面有大量炎症细胞浸润,支架逐步降解,无骨组织形成。4.骨缺损环境成骨情况：组织学和CT影像证实VSC组和SC组修复腓骨标准缺损,VSC组优于SC组；而VS组和S组形成纤维骨不连。5.种子细胞对组织工程骨形成的影响：通过比较分析VSC和VS组、SC和S组平均CT值变化情况,发现在异位成骨环境和骨缺损成骨环境中,四组支架均形成鲜明对比,SC组平均CT值随时间延长逐步升高,形成组织工程骨,而VS、S组平均CT值随时间延长逐步减低,支架降解,无组织工程骨形成。各时间点平均CT值均具有统计学差异。6.血管化对组织工程骨形成的影响：通过分析VSC和SC组支架相对CT值变化情况,发现在异位成骨环境和骨缺损成骨环境中,两组支架均有相似的变化趋势,均随时间逐步升高,不同时间点VSC组成骨量(相对CT值)高于SC组,具有统计学差异；但不同时间段内阶段成骨量(相对CT值之差)比较,仅0-3月有统计学差异。7.血管化对CHA支架降解的影响：通过分析VS和S组支架CT值变化情况,发现在异位成骨环境和骨缺损成骨环境中,两组支架均有相似的变化趋势,均随时间逐步降低,除1月外,各时间点VS组平均CT值低于S组,具有统计学差异；但不同时间段内支架阶段降解量(平均CT值之差)比较,仅0-3月有统计学差异。8.微环境对组织工程骨形成的影响：通过分析SC组在不同成骨环境相对CT值变化,发现在骨缺损成骨环境中各时间点成骨量(相对CT值)高于异位成骨环境,具有统计学差异；但不同时间段内阶段成骨量(相对CT值之差)比较,0-3月、6-9月有统计学差异。9.微环境对CHA支架降解的影响：通过分析S组在不同成骨环境平均CT值变化,发现在骨缺损成骨环境中各时间点平均CT值低于异位成骨环境,具有统计学差异；不同时间段内支架阶段降解量(平均CT值之差)比较,各时间段均有统计学差异。结论1.在大动物比格犬异位成骨环境成功构建带血管蒂的组织工程骨。带血管蒂的细胞支架复合物在体内4周后可以形成含隐动静脉的脉管网络系统,3月后支架表面可见少量组织工程骨的形成,9月后可见含哈弗氏系统样的组织工程骨,带血管蒂组织工程骨的形成进程明显快于无血管蒂组,相关研究未见报道。2.应用带血管蒂的组织工程骨成功修复比格犬腓骨缺损,同时建立组织工程骨体内血管化研究的大动物模型。本模型修复邻近骨缺损无需显微外科吻合,避免了吻合血管固有的失败率；修复远处骨缺损可应用显微外科移植技术。带血管蒂的组织工程骨为构建大体积组织工程骨、修复受区血供不佳的骨缺损提供治疗方案。3.通过CT影像学9个月的长期观察,发现四组支架CT值在不同成骨微环境具有特征性变化。证实种子细胞在组织工程骨形成过程中起重要作用,是构建组织工程骨及修复标准骨缺损所必需；血管化和成骨微环境促进组织工程骨形成和支架降解,在细胞支架复合物植入体内前3个月阶段起重要作用,今后应重点研究前3个月组织工程骨形成过程中的各种影响因素变化情况,优化构建方案更好地促进组织工程骨形成。